Aislamiento de leucocitos de la interfaz humana Materno-fetal

Summary

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Abstract

El embarazo se caracteriza por la infiltración de leucocitos en los tejidos reproductivos y en la interfase materno-fetal (decidua basal y decidua parietal). Esta interfaz es el lugar anatómico de contacto entre la madre y tejidos fetales; Por lo tanto, es un sitio de acción inmunológica durante el embarazo. Leucocitos infiltrantes en la interfase materno-fetal juegan un papel central en la implantación, el mantenimiento del embarazo, y el momento de la entrega. Por lo tanto, caracterizaciones fenotípicas y funcionales de estos leucocitos proporcionarán información sobre los mecanismos que conducen a trastornos del embarazo. Varios protocolos se han descrito con el fin de aislar la infiltración de leucocitos de la decidua basal y decidua parietal; sin embargo, la falta de coherencia en los reactivos, enzimas, y los tiempos de incubación hace que sea difícil comparar estos resultados. Se describe aquí un nuevo enfoque que combina el uso de diss mecánicos y enzimáticos suavesociation técnicas para preservar la viabilidad e integridad de los marcadores extracelulares e intracelulares en los leucocitos aislados de los tejidos humanos en la interfase materno-fetal. Aparte de inmunofenotipo, cultivo celular, y la clasificación de células, las aplicaciones futuras de este protocolo son numerosas y variadas. Siguiendo este protocolo, los leucocitos aislados se pueden utilizar para determinar la metilación del ADN, la expresión de genes diana, pt funcionalidad vitro de leucocitos (es decir, la fagocitosis, citotoxicidad, la proliferación de células T, y la plasticidad, etc.), y la producción de especies reactivas de oxígeno en la interfase materno-fetal. Además, utilizando el protocolo descrito, este laboratorio ha sido capaz de describir nuevos y raros leucocitos en la interfase materno-fetal.

Introduction

El embarazo se caracteriza por tres fases distintas inmunológicos: 1) la implantación y placentación temprana asociada con una respuesta pro-inflamatoria (es decir, la implantación se asemeja a una "herida abierta"); 2) el segundo trimestre y la mayor parte del tercer trimestre del embarazo cuando se logra la homeostasis inmune a través de un estado predominantemente anti-inflamatoria en la interfase materno-fetal; y 3) el parto, un estado pro-inflamatorio ^1-7. Las células inmunes juegan un papel importante en la regulación de la respuesta inflamatoria en la interfase materno-fetal, donde su abundancia y el cambio de localización durante todo el embarazo ^6-9.

En los seres humanos, la interfaz materno-fetal representa un área de contacto directo entre los tejidos materna (decidua) y fetal (corion o trofoblasto). Esta interfaz incluye: 1) la decidua parietal que recubre la cavidad uterina no cubierto por la placenta y es en yuxtaposiciónpara el corion leve; y 2) la decidua basal, que se encuentra en la placa basal de la placenta donde es invadida por los trofoblastos intersticiales ¹⁰ (Figura 1). La intimidad de estas zonas de contacto crea condiciones para la exposición antigénica fetal al ^11-13 materna sistema inmunológico. No es sorprendente, los leucocitos comprenden hasta el 30-40% de las células deciduales ^8,9,14,15 además de las células de tipo estromal típicos y células glandulares ^8,14,16. El papel de los leucocitos en la interfase materno-fetal abarca múltiples procesos que incluyen la limitación de la invasión trofoblástica ^17, la remodelación de las arterias espirales ^18,19, el mantenimiento de la tolerancia materna ^12,20, y el inicio del trabajo ^21-26. Los leucocitos tanto de la adaptación y las extremidades innata del sistema inmune, es decir, las células T, macrófagos, neutrófilos, células B, células dendríticas, y células NK, se han identificado en los tejidos deciduales, y suproporciones y estado de activación se ha demostrado que variar espacialmente y temporalmente durante toda la gestación ^{6-10,12,14,24,27-30.} Las perturbaciones en la población y / o la función de leucocitos están asociados con el aborto espontáneo ^{31, 32} preeclampsia, restricción del crecimiento intrauterino ^32,33, y trabajo de parto prematuro ^7,24. Por lo tanto, el estudio de las características fenotípicas y la funcionalidad de los leucocitos en la interfase materno-fetal humano facilitará la elucidación de las vías inmunológicas dysregulated en los trastornos del embarazo.

Una de las herramientas más poderosas utilizadas para determinar el fenotipo y las propiedades funcionales de los leucocitos se citometría de flujo, la tecnología que permite el análisis cuantitativo de múltiples parámetros simultáneamente ^34-36. Para analizar los leucocitos por citometría de flujo, se requiere aislamiento de los leucocitos en una suspensión de una sola célula. Por lo tanto, un método para separar la infiltración leuSe necesita kocytes desde la interfaz materno-fetal para estudiar su fenotípica y propiedades funcionales.

Varios métodos han sido descritos para aislar los leucocitos desde la interfaz materno-fetal humano ^{10,14,25,27,37-39.} Mientras que algunos se aplican desagregación mecánica ^10,25,27,38, otros utilizan digestión enzimática ^37,40 para la disociación de tejido. Debido a la desagregación mecánica produce un menor rendimiento y reducción de la viabilidad ^41, y la disociación enzimática puede afectar a la viabilidad y la retención de marcador de superficie celular ^42, el método descrito en el presente documento combina la disociación mecánica suave con enzimático pre-tratamiento para aumentar el rendimiento de los leucocitos aislados sin comprometer la viabilidad celular. Una combinación similar de métodos ha demostrado ser eficaz en el aislamiento de leucocitos de los tejidos deciduales en la interfase materno-fetal ^39. Por lo tanto, el protocolo descrito en este documento implica mechadesagregación nica con un disociador tejido automático que aumenta la consistencia, mientras que el ahorro de tiempo y mano de obra en comparación con picado tradicional con escalpelos opuestas, hojas de afeitar o tijeras quirúrgicas ^10,28. La enzima seleccionada para la disociación del tejido era Accutase. A diferencia colagenasa utilizada ^43, Dispasa ^{44, 45} y tripsina, Accutase (una solución desprendimiento celular) combina proteolítica general y actividades colagenolíticas que contribuyen a la disociación eficiente pero suave ^46,47. Después de la disociación, los leucocitos se enriquecen a partir de la población total de las células deciduales por centrifugación en gradiente de densidad. Varios medios de gradiente de densidad se han utilizado previamente, el más común de los cuales son Percoll (una suspensión de partículas de sílice coloidal) y Ficoll ⁴⁸ (un polímero de sacarosa con un alto peso molecular sintético) ^49. La eficacia superior de aislamiento por el polímero sacarosa ha sido Previously muestra ^50, y el protocolo descrito en el presente documento además demuestra que este medio de gradiente de densidad produce una pureza suficientemente alta de los leucocitos mononucleares.

Por lo tanto, el protocolo descrito en el presente documento combina la desagregación tisular mecánico con un disociador automática tejido, la digestión enzimática con una solución de desprendimiento celular, y la separación de leucocitos con un medio de gradiente de densidad (1,077 + 0,001 g / ml) para aislar los leucocitos de tejidos deciduales humanos. Este protocolo se ha demostrado para preservar los antígenos de superficie celular, junto con la viabilidad celular. Los leucocitos aislados se pueden utilizar para múltiples aplicaciones que incluyen inmunofenotipo con citometría de flujo y estudios funcionales in vitro.

Protocol

Este protocolo es apropiado para el aislamiento de leucocitos de la decidua basal y decidua parietal en preparación para inmunofenotipo por citometría de flujo. Además, las células aisladas se pueden utilizar para la clasificación de células, cultivo celular, el aislamiento de ARN, y la citología. Antes de trabajar con las muestras mencionadas en este protocolo, la aprobación ética humana debe ser obtenido de la Comisión de Ética Local Investigación y Juntas de Revisión Institucional. La recolección y util…

Representative Results

. La disección de los tejidos humanos en la interfase materno-fetal (decidua basal y decidua parietal) se muestra en la Figura 1 Este procedimiento incluye la disección de la placa basal, que incluye la decidua basal (Figura 1A – D). La decidua basal se obtiene mediante la eliminación de las vellosidades de la placenta (lado fetal) de la placa basal (Figura 1C). La decidua parietal se recoge raspando suavemente la membrana coriónica (Figura …

Discussion

Caracterización de las propiedades funcionales y fenotípicas de la infiltración de leucocitos en la interfase materno-fetal humano es esencial para la comprensión de los mecanismos inmunológicos que conducen a trastornos del embarazo. Varias técnicas se han descrito con el fin de aislar los leucocitos de la interfaz materno-fetal durante el embarazo humano ^{10,14,25,28,37,42,43.} Sin embargo, cada una de estas técnicas es distinta, utiliza enzimas o combinaciones de enzimas diferentes, requiere diferente…

Materials

			Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers	Any vendor	20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies		(1X PBS)
Large and small Petri dishes	Any vendor
			Dissociation
Accutase	Life Technologies	A11105-01	(cell detachment solution)
Sterile 2 mL safe-lock conical tubes	Any vendor
50 mL conical centrifuge tubes	Any vendor
100 µm cell strainers	FALCON/Corning	352360
5 mL round bottom polystyrene test tubes	Any vendor
Transfer pipettes	Any vendor
C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
			Cell Culture
RPMI culture medium 1640	Life Technologies	22400-089	(1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides	Thermo Scientific	177437
Incubator	Thermo Scientific Corporation	HEPA Class 100
Water bath	Fisher Scientific	ISOTEMP 110
Cell counter	Nexelcom	Cellometer Auto2000
Microscope	Olympus	Olympus CKX41
			Cell Separation
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Cell separator	Miltenyi Biotec	130-042-109
30μm pre-separation filters	Miltenyi Biotec	130-041-40
Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
15mL safe-lock conical tubes	Any Vendor
MACS buffer			(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
			Reagents
FcR Blocking	Miltenyi Biotec	130-059-901	(Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies	BD Biosciences		(Table 1)
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
LIVE/DEAD viability dye	BD Biosciences	564406
Lyse/Fix buffer	BD Biosciences	346202
FACS buffer			(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)
Staining buffer	BD Biosciences	554656
Trypan Blue solution 0.4%	Life Technologies	15250-011
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	20% density gradient media
			Additional Instruments
Incubator with shaker	Thermo Scientific	MAXQ 4450
Flow cytometer	BD Biosciences	LSR-Fortessa
Centrifuge	Beckman Coulter	SpinChron DLX
Vacuum system	Any vendor
Automatic tissue dissociator	Miltenyi Biotec	gentleMACS Dissociator