Co-immunoudfældning af musen Mx1 Protein med influenza A-virus nukleoprotein
Summary
This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.
Abstract
Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.
Introduction
Myxovirus modstand (Mx) proteiner er en vigtig del af det medfødte immunforsvar mod virale patogener. Disse proteiner er store dynamin-lignende GTPaser, der induceres af type I og type III interferoner. De tilsvarende Mx gener er til stede i næsten alle hvirveldyr i en eller flere kopier og deres genprodukter inhibere en bred vifte af vira, herunder Orthomyxoviridae (f.eks., Influenza virus), Rhabdoviridae (f.eks., Vesikulær stomatitis virus), Bunyaviridae (f.eks. , La Crosse-virus) og Retroviridae (fx humant immundefektvirus-1) 1-4. Det er uklart, hvordan disse proteiner genkender en så bred vifte af vira, uden nogen tilsyneladende delt primære sekvens motiver i disse vira. Analyse af samspillet af Mx proteiner med deres virale mål potentielt involverer højere ordens komplekser med andre værtscelleproteiner faktorer vil hjælpe til at forstå de molekylære mekanismer that har udviklet sig i våbenkapløbet mellem vira og deres værter.
Samspillet mellem pattedyr Mx proteiner og virale mål er blevet studeret mest omfattende til human MXA. Humant MXA kan inhibere replikationen af mange vira, herunder orthomyxovira influenza A og Thogoto virus. MXA binder Thogoto virus ribonucleoprotein komplekser (vRNPs) og derved forhindre deres nukleare indrejse, hvilket resulterer i blok for infektion 5. Denne vekselvirkning mellem MXA og Thogoto virus vRNPs er blevet demonstreret med co-sedimentering og co-immunopræcipitationsforsøg 6-9. Hvordan Mx proteiner hindre influenza A-vira er mindre klar. Et stort problem er, at det er ikke ligetil at påvise en vekselvirkning mellem et Mx protein og et influenza genprodukt. En rapport viste en interaktion mellem menneske MXA og NP-proteinet i influenza A-virus inficerede celler 10. Dette samspil kan kun blive vist ved co-immunoprecipitation hvis cellerne var blevet behandlet med de tværbindingsreagens dithiobis (succinimidylpropionat) før lysis, hvilket antyder, at interaktionen er forbigående og / eller svag. Nyere undersøgelser har vist, at forskellen Mx følsomhed af forskellige influenza A stammer bestemmes af oprindelsen af NP-proteinet 11,12. I tråd med dette, kan influenza A-vira dels flygte fra Mx kontrol ved at mutere specifikke rester i NP-proteinet 13. Dette antyder, at det vigtigste mål for influenza A-vira til vært Mx er NP-proteinet, sandsynligvis NP samlet i vRNP komplekser. Men ingen af disse nyere undersøgelser påvist en interaktion mellem influenza NP eller vRNPs og enten human MXA eller mus Mx1.
For nylig viste vi for første gang, en interaktion mellem influenza NP og muse Mx1 protein med en optimeret co-immunfældning protokol 14, som er beskrevet her i detaljer. Generelt co-Immunoprecipitation er en af de mest hyppigt anvendte biokemiske fremgangsmåder til at undersøge protein-protein interaktioner. Denne teknik foretrækkes ofte i forhold til andre teknikker, fx gær to-hybrid, da det giver mulighed for at undersøge protein-protein interaktioner i deres naturlige miljø. Co-immunofældning kan udføres på endogent udtrykte proteiner, hvis antistoffer mod proteinerne af interesse er til rådighed. Alternativt kan proteinerne af interesse udtrykkes i cellen gennem transfektion eller infektion, og et affinitetsmærke kan anvendes. Ud over de ovennævnte fordele, der er beskrevet co-immunofældning protokol tillader påvisning af svage og / eller forbigående protein-interaktioner. Den vigtigste komponent i denne optimerede protokol er tilføjelsen af N-ethylmaleimid (NEM) i cellen lysisbuffer. NEM er et alkylerende reagens, som reagerer med frie thiolgrupper, såsom til stede i cysteiner, ved en pH på 6,5-7,5, for at danne en stabil thio-ester(Figur 1). Ved højere pH, kan NEM også reagere med aminogrupper eller undergå hydrolyse 15. NEM anvendes typisk til at blokere frie thiolgrupper, for at forhindre dannelse af disulfidbinding eller inhibere enzymatisk aktivitet. For eksempel er NEM ofte bruges til at blokere desumoylating enzymer, som er cysteinproteaser. I den beskrevne co-immunfældning protokol blev NEM oprindeligt indeholdt i lysepuffer, fordi det var blevet rapporteret, at sumoylation influenzainfektioner proteiner kan påvirke interaktionen mellem virale proteiner 16. Uventet tilsætning af NEM vist sig at være afgørende for at dokumentere samspillet mellem influenza NP og mus Mx1 ved co-immunofældning. Det er uklart, hvorfor tilsætningen af NEM er afgørende at detektere NP-Mx1 interaktion. Muligvis interaktionen er også forbigående og / eller svag. NEM kunne stabilisere interaktionen, fx ved at bevare en specifik konformation af Mx1, et viralt protein eller endda en ukendt tredje komponent. En sådan stabiliserende virkning af NEM er blevet observeret før, fx for interaktionen mellem ribonukleotidreduktase M1 og dets inhibitor gemcitabin (F2dC) 17. MX1 og NP både indeholde flere cysteinrester, der kunne ændres af NEM. For eksempel en nylig undersøgelse fra Rennie et al. Vist, at en stalkless MXA-variant indeholder tre opløsningsmidler eksponerede cysteinrester, der kan ændres af iodacetamid. Mutere disse rester til seriner påvirkede ikke den enzymatiske aktivitet af MXA, men forhindrede disulfid-medieret aggregering 18. Da disse cysteiner er konserveret i Mx1, tyder det, at de analoge cysteiner i Mx1 kan ændres ved NEM og som sådan indflydelse dens kropsbygning eller opløselighed. Desuden kan NEM også påvirke GTPase aktivitet Mx1, som er afgørende for anti-influenza aktivitet Mx1 den, og derved stabilisere interaktionen mellem Mx1 og NP. Men en direkte virkning af NEM på GTPase Activity af Mx1 er usandsynligt, da NEM også er forpligtet til at registrere samspillet mellem influenza NP og GTPase inaktive mutanter af MX1 protein 14. Det er klart, er der behov for mere forskning for at optrævle effekten af NEM på NP-Mx1 interaktion.
Sammenfattende beskrevne co-immunpræcipitering protokol gør det muligt at studere interaktionen mellem antivirale Mx1 protein og dets virale mål, influenza NP protein. Denne protokol kan også anvendes til at studere andre svage eller forbigående vekselvirkninger, der afhænger af stabilisering af specifikke protein konformationer. Protein-protein-interaktion, der er afhængige af specifikke konformationer er blevet beskrevet før, fx for calcium-bindende proteiner, såsom calmodulin 19. Endelig kunne den positive rolle NEM også anvendes i andre fremgangsmåder, der registrerer protein-protein interaktioner, såsom co-sedimentering assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studer interaktionen mellem antivirale proteiner og deres virale mål er meget vigtigt at forstå detaljerne i den antivirale mekanisme af disse proteiner. Dette kan give ny indsigt i, hvordan vira og deres værter co-udviklet og danne grundlag for udvikling af nye antivirale strategier. Den optimerede co-immunpræcipitering protokollen beskrevet her tillader at studere interaktionen mellem muse Mx1 protein og dets virale mål, influenza NP protein. Det vigtigste aspekt af denne protokol er tilsætningen af NEM i lysepu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af FWO-Vlaanderen, IBS projektet IOF10 / StarTT / 027 og Ghent University Special Research Grant BOF12 / GOA / 014.
Materials
| DMEM high glucose | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | also known as NP40 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoclonal antibody | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | ascites blend of clones A1 and A3 |
| anti-RNP polyclonal serum | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-3133 | directed against A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce | 32106 |
Referências
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).
- Kane, M., et al. MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).
- Liu, Z., et al. The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection. Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).
- Kochs, G., Haller, O. Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).
- Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures. FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).
- Mitchell, P. S., et al. Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA. Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).
- Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus. J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).
- Turan, K., et al. Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome. Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).
- Dittmann, J., et al. Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase. J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).
- Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses. J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).
- Manz, B., et al. Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein. PLoS Pathog. 9 (3), e1003279 (2013).
- Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly. J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).
- Brewer, C. F., Riehm, J. P. Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins. Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).
- Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide. Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).
- Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke. Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).
- Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs. Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle. J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).
