Co-immunoprécipitation de la protéine souris Mx1 avec le virus Influenza A nucléoprotéine

Summary

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Abstract

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

Introduction

Protéines résistance Myxovirus (Mx) sont un élément important de la défense immunitaire innée contre les pathogènes viraux. Ces protéines sont de grandes GTPases dynamine-like qui sont induits par les interférons de type III I et de type. Les gènes Mx correspondantes sont présentes dans pratiquement tous les vertébrés en une ou plusieurs copies et leurs produits géniques inhibent une large gamme de virus, y compris les Orthomyxoviridae (par ex., Virus de la grippe), des Rhabdoviridae (par ex., Virus de la stomatite vésiculaire), Bunyaviridae (par ex. , le virus de la crosse) et Retroviridae (par exemple, virus d'immunodéficience humaine-1) ^1-4. On ne sait pas comment ces protéines reconnaissent une telle large éventail de virus, sans aucune séquence primaire partagé apparente motifs de ces virus. Analyser l'interaction des protéines Mx avec leurs cibles virales, impliquant potentiellement complexes d'ordre supérieur avec d'autres facteurs de la cellule hôte, aidera à comprendre les mécanismes moléculaires tHat ont évolué dans la course aux armements entre les virus et leurs hôtes.

L'interaction entre les protéines de mammifères Mx et cibles virales a été le plus étudié pour MxA humaine. MxA humaine peut inhiber la replication de nombreux virus, y compris l'orthomyxovirus virus influenza A et Thogoto. MxA lie les complexes de ribonucléoprotéine (virus Thogoto vRNPs), empêchant ainsi leur entrée nucléaire, ce qui entraîne l'infection de ⁵ bloc. Cette interaction entre MxA et Thogoto vRNPs de virus a été démontrée avec le co-sédimentation et des expériences de co-immunoprécipitation ^6-9. Comment protéines Mx entravent virus de la grippe A est moins clair. Un problème majeur est qu'il ne est pas aisé de démontrer une interaction entre une protéine Mx et un produit du gène de la grippe. Un rapport a montré une interaction entre MxA humaine et la protéine NP de la grippe A cellules infectées par le virus ^10. Cette interaction ne peut être représenté par la co-immunoprecipitation si les cellules avaient été traités avec les réticulants réactifs dithiobis (propionate de succinimidyle) avant la lyse, ce qui suggère que l'interaction est transitoire et / ou faible. Des études plus récentes ont montré que l'écart-Mx sensibilité de différentes souches de la grippe A est déterminée par l'origine de la protéine NP ^11,12. Dans cette ligne, les virus grippaux A peuvent en partie échapper au contrôle Mx par mutation des résidus spécifiques dans la protéine NP ^13. Cela suggère que la principale cible de virus influenza A pour l'hôte Mx est la protéine NP, probablement NP assemblé dans les complexes vRNP. Cependant, aucune de ces études plus récentes ont démontré une interaction entre l'influenza NP ou vRNPs et MxA soit humain ou de souris Mx1.

Récemment, nous avons montré, pour la première fois, une interaction entre la grippe et la protéine NP de souris MX1 avec une co-immunoprécipitation protocole optimisé ^14, qui est décrit ici en détail. En général, les co-immunoprecipitation est l'une des approches biochimiques les plus fréquemment utilisés pour étudier les interactions protéine-protéine. Cette technique est souvent préférée à d'autres techniques, par exemple, deux hybrides de levure, car il permet d'étudier les interactions protéine-protéine dans leur environnement naturel. Co-immunoprécipitation peut être effectuée sur des protéines exprimées de manière endogène si des anticorps contre les protéines d'intérêt sont disponibles. En variante, les protéines d'intérêt peuvent être exprimés dans la cellule par transfection ou infection et une étiquette d'affinité peuvent être utilisés. En plus des avantages mentionnés ci-dessus, la co-immunoprécipitation protocole décrit permet la détection des interactions faibles de protéines et / ou transitoires. Le composant principal de ce protocole optimisé est l'addition de N-éthylmaléimide (NEM) dans le tampon de lyse des cellules. NEM est un réactif d'alkylation qui réagit avec les groupes thiol libres, tels que présents dans cysteines, à un pH de 6.5 à 7.5 pour former un thio-ester stable(Figure 1). A pH plus élevé, NEM peut également réagir avec des groupes amino ou ¹⁵ subir une hydrolyse. NEM est généralement utilisé pour bloquer les groupes thiol libres, afin d'empêcher la formation de liaisons disulfure ou inhiber l'activité enzymatique. Par exemple, NEM est souvent utilisé pour bloquer les enzymes, qui sont desumoylating proteases cysteine. Dans le protocole décrit co-immunoprécipitation, NEM a été inscrite dans le tampon de lyse car il a été rapporté que la sumoylation de protéines de la grippe peut influencer l'interaction entre des protéines virales ^16. De façon inattendue, l'addition de NEM se est avéré être la clé pour documenter l'interaction entre l'influenza NP et Mx1 souris par co-immunoprécipitation. Il est difficile de comprendre pourquoi l'addition de NEM est crucial pour détecter l'interaction NP-MX1. Peut-être l'interaction est trop transitoire et / ou faible. NEM pourrait stabiliser l'interaction, par exemple, en conservant une conformation spécifique de Mx1, une protéine virale ou même une troisième compo inconnuenent. Un tel effet stabilisant de NEM a été observé précédemment, par exemple, par l'interaction entre la ribonucléotide réductase M1 et son inhibiteur de gemcitabine (F2dC) ^17. NP MX1 et deux contiennent de multiples résidus de cysteine ​​qui pourraient être modifiés par NEM. Par exemple, une étude récente de Rennie et al. A démontré qu'un sessiles MxA variante contient trois résidus de solvants cystéine exposés qui peuvent être modifiés par l'iodoacétamide. La mutation de ces résidus serines ne influence pas l'activité enzymatique de MxA, mais empêche l'agrégation à médiation par ¹⁸ disulfure. Étant donné que ces cysteines sont conservées dans Mx1, cela suggère que les cysteines dans Mx1 analogues peuvent être modifiées par NEM et en tant que tel ou sa conformation influence la solubilité. En outre, NEM peut également affecter l'activité GTPase de Mx1, ce qui est essentiel pour l'activité anti-influenza de Mx1, et ainsi stabiliser l'interaction entre MX1 et NP. Cependant, un effet direct de NEM sur la GTPase activité de Mx1 est peu probable, car NEM est également nécessaire pour détecter l'interaction entre la grippe NP et GTPase mutants inactifs de la protéine Mx1 ^14. De toute évidence, plus de recherche est nécessaire pour démêler l'effet de NEM sur l'interaction NP-MX1.

En résumé, la co-immunoprécipitation protocole décrit permet d'étudier l'interaction entre la protéine antivirale MX1 et sa cible virale, la protéine NP grippe. Ce protocole peut également être utilisé pour étudier d'autres interactions faibles ou transitoires qui dépendent de la stabilisation des conformations de protéines spécifiques. Interaction protéine-protéine qui dépendent de conformations spécifiques ont été décrits auparavant, par exemple, pour les protéines liant le calcium, tels que ¹⁹ la calmoduline. Enfin, le rôle bénéfique de NEM pourrait également être utilisé dans d'autres procédés qui permettent de détecter les interactions protéine-protéine, telles que les essais de co-sédimentation.

Protocol

Remarque: Le protocole de transfection et de co-immunoprécipitation suivante est établie pour un format de boîte de Pétri de 9 cm. D'autres formats sont également possible, après avoir escaladé le protocole. 1. ensemencement des rein embryonnaire humain (HEK) 293T Ensemencer les cellules HEK293T un jour avant la transfection à 1,2 x 10 6 cellules par 9 cm boîte de Pétri dans 12 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de s?…

Representative Results

N-éthylmaléimide est un composé organique qui peut être utilisé pour modifier de manière irréversible des groupes thiol libres, par exemple pour inhiber les proteases cysteine ​​(figure 1). La protéine antiviral inhibe la grippe A Mx1 la replication du virus en interagissant avec la nucléoprotéine virale. Le protocole de co-immunoprécipitation optimisé décrit ici permet d'étudier cette interaction NP-MX1. des cellules HEK293T ont été transfec…

Discussion

L'étude de l'interaction entre les protéines antivirales et leurs cibles virales est très important de comprendre les détails du mécanisme antiviral de ces protéines. Cela peut donner de nouvelles perspectives sur la façon dont les virus et leurs hôtes co-évolué et être la base pour le développement de nouvelles stratégies antivirales. Le protocole de co-immunoprécipitation optimisé décrit ici permet d'étudier l'interaction entre la protéine de la souris MX1 et sa cible virale, la prot?…

Materials

DMEM high glucose	Gibco	52100-047
N-Ethylmaleimide	Sigma	E-3876	Toxic
Igepal CA-630	Sigma	I-30212	also known as NP40
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11 873 580 001
anti-NP monoclonal antibody	NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository	NR-4282	ascites blend of clones A1 and A3
anti-RNP polyclonal serum	NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository	NR-3133	directed against A/Scotland/840/74 (H3N2)
Protein G Sepharose 4FF	GE Healthcare	17-0618-01
Hyperfilm ECL 18 x 24 cm	GE Healthcare	28-9068-36
ECL Western Blotting Substrate	Pierce	32106