インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降
Summary
This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.
Abstract
Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.
Introduction
ミクソウイルス抵抗（MX）タンパク質は、ウイルスの病原体に対する先天性免疫防御の重要な部分である。これらのタンパク質は、I型およびIII型インターフェロンにより誘導される大ダイナミン様GTPアーゼである。対応のMx遺伝子は、1つまたは複数のコピーのほぼすべての脊椎動物に存在し、それらの遺伝子産物は、 オルソミクソウイルス科 （ 例えば 、インフルエンザウイルス）、 ラブドウイルス科 （ 例えば 、水疱性口内炎ウイルス）、 ブニヤウイルス科 （ 例えば含む、広範囲のウイルスを阻害する。 、ラクロスウイルス）およびレトロウイルス （ 例えば、ヒト免疫不全ウイルス-1）1-4。それは、これらのタンパク質は、これらのウイルスの任意の明白な共有の一次配列モチーフのないウイルスのような幅広い配列を、認識かは不明である。潜在的に、それらのウイルス標的にはMxタンパク質の相互作用を分析する他の宿主細胞因子との高次複合体を含む、トン分子機構を理解するのに役立ちます帽子は、ウイルスとそのホスト間の軍拡競争に進化してきた。
哺乳類のMxタンパク質およびウイルス標的の間の相互作用は、ヒトMxAの最も広く研究されてきた。人間のMxAはオルトミクソウイルス、インフルエンザAおよびThogotoウイルスを含む多くのウイルスの複製を阻害することができる。のMxA、それによって感染5のブロックになりそれらの核侵入を防止、Thogotoウイルスリボ核タンパク質複合体（vRNPs）に結合する。のMxAとThogotoウイルスvRNPsとの間のこの相互作用は、共同沈降と共免疫沈降実験6-9で実証されている。 Mxのタンパク質は、インフルエンザAウイルスを妨げる方法あまり明らかではない。一つの大きな問題は、Mx蛋白質とインフルエンザ遺伝子産物間の相互作用を実証するために簡単ではないということである。一つのレポートには、インフルエンザウイルスに感染した細胞10を人間のMxAおよびNPタンパク質との間の相互作用を実証した。この相互作用は、唯一の共同immunoprによって示すことができたecipitation細胞が相互作用は一過性および/または弱であることを示唆し、溶解する前に、架橋試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）で処理した場合。より最近の研究は、異なるインフルエンザA株の差動Mxの感度はNPタンパク質11,12の起点によって決定されることを示した。これに伴い、A型インフルエンザウイルスは、部分的にNPタンパク質13内の特定の残基を変異させることによりMxの制御から逃れることができます。これは、ホストのA型インフルエンザウイルスの主要なターゲットはMxのはおそらくNPがvRNP複合錯体で組み立て、NPタンパク質であることを示唆している。しかし、これらのより最近の研究はいずれも、インフルエンザNPまたはvRNPsおよびヒトのMxAまたはマウスMx1のいずれかの間の相互作用を示さなかった。
最近では、初めて、インフルエンザNPおよび、ここでは詳細に説明されて最適化された共免疫沈降プロトコル14、マウスMx1のタンパク質との間の相互作用を示した。一般に、コのimmunoprecipitationは、タンパク質 – タンパク質相互作用を研究するために最も頻繁に使用される生化学的アプローチの一つである。それは、それらの天然の環境におけるタンパク質-タンパク質相互作用を調査することを可能にするので、この技術は、多くの場合、代替技術、 例えば、酵母ツーハイブリッドよりも好ましい。目的のタンパク質に対する抗体が利用可能である場合、共免疫沈降は、内因的に発現されるタンパク質に行うことができる。あるいは、目的のタンパク質は、トランスフェクションまたは感染を介して細胞内で発現させることができ、親和性タグを使用することができる。上記の利点に加えて、説明し、共免疫沈降プロトコルは、弱いおよび/または一過性タンパク質相互作用の検出を可能にする。この最適化されたプロトコルの主な成分は、細胞溶解緩衝液中にN-エチルマレイミド（NEM）の添加である。 NEMは、安定したチオエステルを形成するために、6.5〜7.5のpHで、そのようなシステイン中に存在する遊離チオール基と反応するアルキル化試薬である（ 図1）。より高いpHでは、NEMは、アミノ基と反応または加水分解15を受けることができる。 NEMは、典型的には、ジスルフィド結合の形成を防止または酵素活性を阻害するために、遊離チオール基をブロックするために使用される。例えば、NEMは、多くの場合、システインプロテアーゼであるdesumoylating酵素をブロックするために使用される。それはインフルエンザタンパク質のSUMO化は、ウイルスタンパク質16との間の相互作用に影響を与えることができることが報告されていたので、記載の免疫共沈降プロトコルでは、NEMは、最初の溶解緩衝液に含まれていた。予想外に、NEMの添加は、共免疫沈降によってインフルエンザNPおよびマウスMx1の間の相互作用を文書化キーであることが判明した。 NEMの添加は、NP-Mx1の相互作用を検出することが重要である理由は不明である。おそらく相互作用があまりにも一過性および/または弱い。 NEMは、Mx1の特定のコンホメーションを保存することにより、例えば 、ウイルスタンパク質、あるいは未知の第三のコンポを相互作用を安定させることができポーネント。 NEMのこのような安定化効果は、リボヌクレオチド還元酵素M1とその阻害剤ゲムシタビン（F2dC）17との間の相互作用のために、例えば 、以前に観察されている。 Mx1のとNPの両方がNEMによって修正することができる複数のシステイン残基を含む。例えば、レニーらによる最近の研究はstalkless MxAの変異はヨードアセトアミドにより修飾することができる3つの溶媒露出したシステイン残基を含有することを実証した。セリンにこれらの残基を変異することのMxAの酵素活性に影響を与えるが、ジスルフィド媒介凝集18を妨げませんでした。これらのシステインはMx1の中で保存されているように、これはMx1の中の類似のシステインがNEMによって、そのような影響は、そのコンホメーまたは溶解度のように変形することができることを示唆している。また、NEMもMx1の抗インフルエンザ活性に必須であるMx1の、のGTPase活性に影響を与え、それによってMx1のとNPとの相互作用を安定化させるかもしれない。しかし、GTPアーゼACTI上のNEMの直接の効果NEMはまた、インフルエンザNPおよびGTPアーゼMx1のタンパク質14の非アクティブな変異体の間の相互作用を検出する必要があるとしてMx1ののVITYは、ほとんどありません。明らかに、より多くの研究がNP-Mx1の相互作用にNEMの影響を解明するために必要とされる。
要約すると、説明した共免疫沈降プロトコルは、抗ウイルスMx1のタンパク質とそのウイルス標的、インフルエンザNPタンパク質間の相互作用を研究することができます。このプロトコルは、特定のタンパク質コンフォメーションの安定化に依存する他の弱いまたは一時的な相互作用を研究するために使用することができる。特定のコンホメーションに依存する、タンパク質-タンパク質相互作用は、カルモジュリン19などのカルシウム結合タンパク質のために、例えば 、以前に記載されている。最後に、NEMの有益な役割はまた、そのような共沈降アッセイなどのタンパク質 – タンパク質相互作用を検出する他の方法で使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
抗ウイルス性タンパク質およびそれらのウイルス標的の間の相互作用を研究することは、これらのタンパク質の抗ウイルス機構の詳細を理解することが非常に重要である。これは、ウイルスとそのホストが共同どのように進化したかに新たな洞察を与え、新たな抗ウイルス戦略の開発のための基礎となり得る。ここで説明する最適化された共免疫沈降プロトコルは、マウスMx1のタンパク質と?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はFWO-ブラーンデレン、IOFプロジェクトIOF10 / STARTT / 027とゲント大学特別研究助成BOF12 / GOA / 014によってサポートされていました。
Materials
| DMEM high glucose | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | also known as NP40 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoclonal antibody | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | ascites blend of clones A1 and A3 |
| anti-RNP polyclonal serum | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-3133 | directed against A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce | 32106 |
Referências
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).
- Kane, M., et al. MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).
- Liu, Z., et al. The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection. Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).
- Kochs, G., Haller, O. Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).
- Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures. FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).
- Mitchell, P. S., et al. Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA. Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).
- Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus. J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).
- Turan, K., et al. Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome. Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).
- Dittmann, J., et al. Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase. J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).
- Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses. J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).
- Manz, B., et al. Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein. PLoS Pathog. 9 (3), e1003279 (2013).
- Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly. J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).
- Brewer, C. F., Riehm, J. P. Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins. Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).
- Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).
- Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide. Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).
- Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke. Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).
- Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs. Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle. J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).
