Co-inmunoprecipitación de la proteína de ratón Mx1 con la Influenza A nucleoproteína del virus
Summary
This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.
Abstract
Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP–Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.
Introduction
Resistencia Myxovirus (Mx) las proteínas son una parte importante de la defensa inmune innata contra los patógenos virales. Estas proteínas son grandes GTPasas-dynamin como que son inducidos por el tipo I y tipo III interferones. Los genes MX correspondientes están presentes en casi todos los vertebrados en una o varias copias y sus productos génicos inhiben una amplia gama de virus, incluyendo Orthomyxoviridae (por ejemplo., Virus de la gripe), Rhabdoviridae (por ejemplo., Virus de la estomatitis vesicular), Bunyaviridae (por ejemplo. , el virus de la crosse) y Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana-1) 1-4. No está claro cómo estas proteínas reconocen una amplia gama de virus tales, sin ninguna secuencia primaria compartida aparente motivos en estos virus. El análisis de la interacción de proteínas Mx con sus objetivos virales, potencialmente involucra complejos de orden superior con otros factores de la célula huésped, le ayudará a comprender los mecanismos moleculares tsombrero de haber evolucionado en la carrera armamentista entre los virus y sus anfitriones.
La interacción entre las proteínas de mamíferos Mx y objetivos virales se ha estudiado más ampliamente para MxA humano. MxA humano puede inhibir la replicación de muchos virus, incluyendo el ortomixovirus influenza A y virus Thogoto. MxA une los complejos de ribonucleoproteína virus Thogoto (vRNPs), impidiendo de este modo su entrada nuclear, lo que resulta en el bloque 5 de la infección. Esta interacción entre MXa y Thogoto vRNPs virus se ha demostrado con co-sedimentación y co-inmunoprecipitación experimentos 6-9. Cómo proteínas Mx obstaculizan virus de influenza A que está menos claro. Un problema importante es que no es fácil de demostrar una interacción entre una proteína Mx y un producto génico influenza. Un informe mostró una interacción entre MxA humana y la proteína NP de la gripe A células infectadas por virus 10. Esta interacción sólo se pudo demostrar por co-immunoprecipitation si las células habían sido tratados con los ditiobis reactivo de reticulación (propionato de succinimidilo) antes de la lisis, lo que sugiere que la interacción es transitorio y / o débil. Estudios más recientes han demostrado que el diferencial Mx sensibilidad de las distintas cepas de la gripe A se determina por el origen de la proteína NP 11,12. En línea con esto, los virus de la influenza A pueden escapar parte del control Mx mutando residuos específicos en la proteína NP 13. Esto sugiere que el principal objetivo de los virus de la gripe A para el host Mx es la proteína NP, probablemente NP montado en complejos vRNP. Sin embargo, ninguno de estos estudios más recientes demostraron una interacción entre la gripe NP o vRNPs y, o bien MxA humano o de ratón Mx1.
Recientemente hemos demostrado, por primera vez, una interacción entre la influenza NP y la proteína Mx1 de ratón con un protocolo de co-inmunoprecipitación optimizado 14, que se describe aquí en detalle. En general, co-immunoprecipitation es uno de los enfoques bioquímicos utilizados más frecuentemente para investigar las interacciones proteína-proteína. Esta técnica se prefiere a menudo sobre las técnicas alternativas, por ejemplo, dos híbridos de levadura, ya que permite investigar las interacciones proteína-proteína en su entorno natural. Co-inmunoprecipitación se puede llevar a cabo en las proteínas expresadas endógenamente si los anticuerpos contra las proteínas de interés están disponibles. Alternativamente, las proteínas de interés se pueden expresar en la célula a través de la transfección o infección y una etiqueta de afinidad pueden ser utilizados. Además de las ventajas mencionadas anteriormente, el protocolo de co-inmunoprecipitación descrita permite la detección de interacciones débiles y / o transitorios de proteínas. El componente principal de este protocolo optimizado es la adición de N-etilmaleimida (NEM) en el tampón de lisis celular. NEM es un reactivo de alquilación que reacciona con los grupos tiol libres tales como presente en cisteínas, a un pH de 6.5 a 7.5, para formar un éster tio-estable(Figura 1). A mayor pH, NEM también puede reaccionar con grupos amino o someterse a hidrólisis 15. NEM se utiliza típicamente para bloquear los grupos tiol libres, con el fin de prevenir la formación de enlaces disulfuro o inhibir la actividad enzimática. Por ejemplo, NEM se utiliza a menudo para bloquear enzimas desumoylating, que son proteasas de cisteína. En el protocolo de co-inmunoprecipitación descrita, NEM se incluyó en el tampón de lisis porque había sido informado de que la sumoilación de las proteínas de la gripe puede influir en la interacción entre las proteínas virales 16. Inesperadamente, la adición de NEM resultó ser clave para documentar la interacción entre la gripe NP y el ratón Mx1 por co-inmunoprecipitación. No está claro por qué la adición de NEM es crucial para detectar la interacción NP-Mx1. Posiblemente la interacción es demasiado transitoria y / o débil. NEM podría estabilizar la interacción, por ejemplo, mediante la preservación de una conformación específica de Mx1, una proteína viral o incluso un tercero desconocido componente. Tal efecto estabilizador de NEM se ha observado antes, por ejemplo, para la interacción entre la ribonucleótido reductasa M1 y su gemcitabina inhibidor (F2dC) 17. Mx1 y NP ambos contienen múltiples residuos de cisteína que podrían ser modificados por NEM. Por ejemplo, un estudio reciente de Rennie et al. Demostró que una variante sin pecíolo MxA contiene tres residuos de cisteína expuestos de disolventes que pueden ser modificados por yodoacetamida. La mutación de estos residuos de serinas no influyó en la actividad enzimática de MxA, pero impide la agregación mediada por disulfuro de 18. Como estas cisteínas se conservan en Mx1, esto sugiere que las cisteínas análogos en Mx1 pueden ser modificados por NEM y como tal influencia su conformación o solubilidad. Además, NEM también podría afectar a la actividad GTPasa de Mx1, que es esencial para la actividad anti-influenza de Mx1, y con ello estabilizar la interacción entre Mx1 y NP. Sin embargo, un efecto directo de NEM en la GTPasa actividad de Mx1 es improbable, ya que también se requiere NEM para detectar la interacción entre la gripe NP y GTPasa mutantes inactivas de la proteína Mx1 14. Claramente, se necesita más investigación para desentrañar el efecto de NEM en la interacción NP-Mx1.
En resumen, el protocolo de co-inmunoprecipitación descrita permite estudiar la interacción entre la proteína antiviral Mx1 y su diana viral, la proteína NP de la gripe. Este protocolo también podría ser utilizado para estudiar otras interacciones débiles o transitorios que dependen de la estabilización de las conformaciones de proteínas específicas. Interacción proteína-proteína que dependen de conformaciones específicas se han descrito antes, por ejemplo, para las proteínas de unión a calcio tales como calmodulina 19. Por último, el papel beneficioso de NEM también podría ser utilizado en otros métodos que detectan interacciones proteína-proteína, tales como ensayos de co-sedimentación.
Protocol
Representative Results
Discussion
El estudio de la interacción entre las proteínas antivirales y sus dianas virales es muy importante para entender los detalles del mecanismo antiviral de estas proteínas. Esto puede dar nuevas pistas sobre cómo coevolucionado virus y sus anfitriones y ser la base para el desarrollo de nuevas estrategias antivirales. El protocolo de co-inmunoprecipitación optimizado descrito aquí permite estudiar la interacción entre la proteína Mx1 de ratón y su diana viral, la proteína NP de la gripe. El aspecto más importan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por FWO-Vlaanderen, el proyecto IOF IOF10 / stARTT / 027 y la Universidad de Gante Especial de Becas de Investigación BOF12 / GOA / 014.
Materials
| DMEM high glucose | Gibco | 52100-047 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E-3876 | Toxic |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | also known as NP40 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11 873 580 001 | |
| anti-NP monoclonal antibody | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-4282 | ascites blend of clones A1 and A3 |
| anti-RNP polyclonal serum | NIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository | NR-3133 | directed against A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 cm | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Pierce | 32106 |
Referências
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