Ex vivo Kultur av Pharyngeal Arches att studera hjärta och muskelstamfäder och deras nisch
Summary
Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.
Abstract
Svalg mesoderm utvecklings embryon bidrar till breda områden av huvud och hjärta muskulatur. Vi har utvecklat en ny metod för att studera huvud och hjärta stamceller utveckling med svalg bågar (även känd som brankiala bågar) ex vivo. Med denna metod har vi nyligen beskrivit att den andra svalg bågen innehåller självförnyande hjärt stamceller och fungerar som en mikro för expansion av stamceller under mushjärta utveckling. Progenitorcellerna förbli odifferentierade och expansiv inuti bågen, men snabbt bli funktionella kardiomyocyter då de migrerar ut ur bågen. Vi rapporterade också att första svalget båge innehåller muskel stamceller som ger upphov till myotuber efter att ha lämnat bågen. Här visar vi förfarandet för dissekering och ex vivo kultur av första och andra svalg bågar från utvecklings musembryon. Metoden gör det möjligt att studera huvud och hjärta stamfader / muskel deveckling, inklusive cardiomyocyte och myotube bildning i detalj ex vivo.
Introduction
Svalg mesoderm celler ger upphov till delar av hjärtat och svalget muskler. Under fosterutvecklingen, multihjärt progenitorceller från andra hjärt fältet migrera från svalg mesoderm och fylla hjärt utflöde och höger kammare, och deras onormal utveckling är nära förknippad med medfödd hjärtsjukdom-den vanligaste orsaken till fosterskador och födelse Defekt- relaterade dödsfall hos människor 1-3. Nyligen genomförda studier har visat att svalg mesoderm bidrar att huvudet muskler, förutom till hjärtat, vilket gör mesoderm en kritisk del av hjärt-kraniofaciala utveckling 4. Således utvecklingsprocesser inklusive induktion, proliferation och differentiering av huvud och hjärta stamceller i svalg mesoderm är under aktiv utredning 5-7.
Tills nyligen, var det fortfarande okänt om hjärt progenitorceller genomgår expansions without differentiering, delvis på grund av bristen på information om deras cellulära miljö. Vår senaste undersökning visar att svalg valv fungera som en mikro för förnyelse av hjärt- och muskel stamceller och kan odlas ex vivo under flera veckor 8. Denna Explantation metod erbjuder en ny och unik möjlighet att studera utvecklingen av hjärt-kraniofaciala stamceller ex vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna video visar vi hur man kan isolera och kultur första och andra svalg valv av 9,5 dagar gamla musembryon. Svalget valv är övergående, segmenterade utbuktningar som visas på craniolateral sidan utvecklings embryon 9, som innehåller flera potenta hjärt progenitorceller-byggstenar för att få hjärtat under embryogenes 10,11 -I andra valv och huvud muskel stamceller i första bågar 8 .
Dissekering av svalget valv kräver avancerade mus embryo dis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).
Materials
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10cm petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) à (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 | |
Referências
- Kelly, R. G. The second heart field. Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
