为靶向治疗耐药性十分普遍,有必要确定耐药机制 – 前或后临床发作 – 是指导临床的替代管理策略的关键。在这里,我们提出了一个协议,以在体外测序耐药行夫妇的推导,以加快发现这些机制。
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
肿瘤基因组强劲的测序技术和改进的数据分析工具的具体分子特征,导致关键基因改变的特定类型癌症1,2的发现。靶向疗法旨在这些遗传病变,如HER2,BCR-ABL,EGFR和ALK的发展,已经显著生活质量的提高患者1,2-。然而,尽管这种方法的特异性,所述临床反应最单一疗法一直亚最佳为电阻最终出现。近日,显著的进展已经取得理解性的分子基础,以有针对性的治疗。有趣的是,这是越来越明显的阻力的一个突出机制涉及持久性目标/通路活性。作为一个典型的例子,雄激素受体(AR)-directed enzalutamide前列腺癌的治疗导致激活的AR本身的突变,保持富集AR-信号OUTPUT里的抑制剂3-5的存在。这方面的知识,导致积极运动,以1)开发的第三代拮抗剂,可以继续在抑制WT和突变AR功能enzalutamide抗性前列腺3和2)确定的AR信令可能被靶向用于治疗性干预的潜在下行节点。同样,耐其它类抑制剂如靶向EGFR,BRAF和ABL往往会导致该激活原有上瘾激酶途径1突变。
与电阻不可避免地出现在大多数患者的认识,发展的办法,尽快将这些机制,光线将允许有效的后续治疗发展。正被广泛使用的一种方法是,分析的临床难治的肿瘤基因组学相对于初治或敏感的肿瘤,以确定在遗传病变富集/枯竭可能适合与d地毯的发现。尽管它的诺言,还有这种方法的两个主要责任妨碍快速发现。首先,获得及时获得肿瘤材料基因组审讯可以作为一个显著障碍从治疗转向治愈。其次,遗传病变的抗性设置无数的去卷积可以是具有挑战性的,因为肿瘤可呈现显著肿瘤内异质6,7。
鉴于这些挑战,人们日益依赖的耐药机制临床前发现。这种方法可以允许鉴定突出的耐药机制的临床试验1可以指导临床替代管理策略在承担治疗前这些机制的一个或下发性的患者之前。
一个这样的临床前发现的工具,正在被广泛使用的是采用无偏功能RNAi筛选。对于考试PLE,惠特克和他的同事应用基因组规模的RNAi筛选,以确定NF1损失通过持续MAPK信号通路的激活8介导的抗RAF和MEK抑制剂。这些结果被认为是临床上相关的作为丧失功能的突变NF1 BRAF中-mutant肿瘤细胞,以抑制RAF和在黑素瘤肿瘤抗vemurafenib活化8内在抗性进行观察。然而,尽管这种方法的成功,许多临床相关指标经常没有确定,大概是由于丧失功能的偏压这种方法。
相反,较少偏见工具的抗性机制的临床前的发现包括通过长时间暴露于的加上NGS基于基因组或转录组仿形兴趣化合物抗性细胞系的产生。这种方法已成功地由几个组实施,以确定自发复发性单核苷酸变异或表达的改变,使电阻5,9,10。例如,在AR中的经常F876L突变最近发现在体外 3-5抗性克隆,并在之前识别该突变的异种移植肿瘤在体内 5在诊所4。最近,Bhang和他的同事(2015)中使用ClonTracer两种临床相关模型来显示,多数长时间暴露于药物过程中出现的是一个预先存在的亚群这表明大多数功能相关的突变的部分抗性克隆的11很可能已经预先存在在选择11成为选择。
相对于前面讨论肿瘤的基因组分析,为“同质”性克隆用于分析由少异质性这一做法的好处有利于潜在的司机更准确的遗传剖析。 Furtherm矿石,令人兴奋的,除了用于发现耐药机制的潜力,这种方法也可以应用于以确定行动的细胞机制的生物活性的小分子和目标的量此信息是未知的10。给出明确的优势,这种方法的多种用途,在这里,我们提出了一个协议,详细说明成功实施这样的临床前屏幕,最大限度地为临床意义的发现的潜力。
选择细胞系(S)的:遗传状态,基因组不稳定性特征
毫无疑问,在成功地揭示临床相关耐药机制的一个最重要的因素是初始小区选线。两个因素应予以考虑。首先,目的是选择相同谱系/亚型窝藏该疾病的定义遗传性状的细胞系(多个)(例如,BRAF V600E在黑素瘤)。公开可用的转录和变异数据,这两种细胞系30-32和主/转移瘤,适用于各种适应症33,34的讯问将有利于选择过程。虽然鉴定细胞系临床相关的遗传改变是理想的,在某些情况下,这是不可能的,由于缺乏可用的细胞系或可行由于因素如困难筛选过程的和长度。
<p class="jove_content">至于前面提到的一点,第二个因素则在细胞系的选择考虑的是易用性还是性使用所需行筛选的可行性。例如,因素,如扩散和内在的突变率可以发现的速度极大地影响。为此目的,细胞系可以利用更快的生长动力学和缺失中的希望的DNA的MMR机制自发耐药性的出现可以加速35。基于所述COSMIC数据库,几个候选细胞系缺乏存在两种常见的突变基因,MMR,MSH2或MLH1酮( 表2和3)。或者,如果所关注的细胞系中不MMR,与物理或DNA的反应性化学诱变剂的急性治疗存在轴承缺陷如烷基化剂N-乙基-N- -nitrosourea(ENU)可用于提高基因组不稳定性。虽然这两种方法可能显著s ^霍顿获得抗性克隆和后续测序时,严格的功能测试应该在候选基因作为更大数量的非功能性来进行,乘客的突变是可能出现。 SNVs可以排名责令最大化机会识别功能相关的基因突变。首先,选择那些反复发作的独立克隆的突变会增加这些突变性的驱动程序的可能性。在事件经常突变的尚未鉴定的,着眼于适合的药物作用机制SNVs(例如,药物靶标或药物靶的已知下游效应)可能是有意义的。最终,金标准是始终候选SNVs异位cDNA表达在药物敏感的亲代细胞的抗性的活性的实验评价。DNA VS RNA测序
一旦抗性克隆已经生成,DNA和/或RNA可以根据需要进行测序。 DNA测序,无论是外显子组或全基因组测序,将允许鉴定的种系和体细胞的变体,如单核苷酸多态性,插入缺失和拷贝数变体。而更经济友好外显子测序着重从已知的编码区上生成读,全基因组测序将产生的测序数据为整个基因组,其可有利于在非编码元件如增强或miRNA的36鉴定的突变。然而,由于基因表达数据不是DNA测序期间衡量,这是很难预测哪些突变很可能是一个功能的驱动程序。在这方面,核糖核酸的测序,尽管成本更高,提供这种优势。即只对表达的RNA种类进行突变呼叫的事实增强了可能性感兴趣的突变可以是功能性的驱动程序。除了允许突变更集中的调查,为后续功能测试,RNA测序也提供了能够鉴定基因表达的改变,剪接和新的嵌合RNA种类,包括基因融合,可能也有助于电阻的作为强有力的驱动额外的好处。
生物信息学管道
提供用于说明目的例如命令,但更详细的文档和教程可以从Broad研究所16,应该开始NGS分析前仔细阅读。下面的命令是针对已经预先安装了所有的工具和参考的数据在一个系统上的UNIX shell环境。这些命令也假定FASTQ文件含配对末端序列从两个样品读取,命名为“父母”和“抗性”,已收到来自厂商和放置在“数据”目录。在大多数情况下,这些命令应适应或使用其他命令行参数的特定应用进行优化uments( 例如 ,添加“-t 8”的BWA命令允许在多线程操作在8个CPU核心)。读组(其分配比对生物样品),必须经常被添加到BAM文件,即使有每咣文件只有一个样本中,为了遵守文件格式要求某些工具。阅读组参数RGID,RGSM,RGPL,RGPU和RGLB可以是任意的字符串描述样品名称,测序平台和库策略。
体外 VS 体内试验
虽然确定了体外选择几个耐药机制已被证实是临床相关的,存在一种可能性,即机制可能不服务于临床电阻相关或主要机制。其原因之一可以包括用于微环境中行驶阻力来治疗中起重要作用,一个组件,不含在实验方案/设置ð迄今iscussed。实际上,一些研究表明,抗癌剂,其能够杀死肿瘤细胞被失效当肿瘤细胞在基质细胞暗示阻力由基质37,38赋予固有机制的存在下培养。鉴定这类基质诱导获得性抗性机制,可以考虑进行体外共培养或体内肿瘤耐药性测定。由于前者测定法是相当复杂的,许多都使出产生耐药肿瘤异种移植物,解决了基质中驱动阻力的潜在作用。这样的研究已经发现相对于体外选择抗性的,两个相同的5和39的独特的机制,这意味着该基质可能确实起到在后者的作用。然而,必须牢记的时间长度可能需要产生这种抗性肿瘤和后续基因组分析-complexitie的复杂性的原因可能会在肿瘤内的分子和细胞异质性。
目标识别
除了揭示耐药机制,这NGS系的基因组谱的方法也可以应用于以确定化学探针的细胞靶。在历史上,多种无偏方法已经被用于识别操作的细胞机制的低分子量的化学品具有生物活性,包括亲和纯化加上定量蛋白质组学,酵母基因组的方法,筛选RNA干扰,和计算推理办法40和目标。作为一个扩展使用NGS-基于基因组或转录组表型耐药细胞群,鉴定独特的经常性的单核苷酸变异(SNVs)或表达变化的分析,使电阻可提供见解化合物的功能性细胞靶点药物耐药机制的阐明。 Ť他是基于如下思想的观察抗性机制的一个子集可以涉及经常突变的基因编码的小分子的直接蛋白质靶。最近,几个报告证实了该方法的效用,特别是与其它方法包括大型癌细胞的敏感性分析相结合,以揭示小分子的细胞目标探测9,10。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |