Etablering og karakterisering af UTI og CAUTI i en musemodel

Summary

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Abstract

Urinvejsinfektioner (UTI) er meget udbredt, en væsentlig årsag til sygelighed og er i stigende grad resistente over for behandling med antibiotika. Hunner er uforholdsmæssigt ramt af UTI: 50% af alle kvinder vil have en UTI i deres levetid. Derudover 20-40% af disse kvinder, der har en indledende UTI vil lide en gentagelse med nogle lider hyppige gentagelser med alvorlig forværring af livskvaliteten, smerter og ubehag, afbrydelse af daglige aktiviteter, øget udgifter til sundhedsvæsenet, og få behandlingsmuligheder andre end langsigtede antibiotisk profylakse. Uropatogen Escherichia coli (UPEC) er den primære agens af fællesskab erhvervede UTI. Kateter-associeret UTI (CAUTI) er den mest almindelige hospital erhvervet infektion tegner sig for en million forekomster i USA årligt og dramatiske udgifter til sundhedsvæsenet. Mens UPEC er også den primære årsag til CAUTI, andre agenser er af øget betydning, herunder Enterococcusfaecalis. Her udnytter vi to veletablerede musemodeller, der rekapitule- mange af de kliniske karakteristika for disse menneskelige sygdomme. For UTI, en C3H / høne model sammenfatter mange af funktionerne i UPEC virulens observeret hos mennesker, herunder vært reaktioner, IBC dannelse og filamentering. For CAUTI, en model med C57BL / 6-mus, som bevarer kateter blære implantater, har vist sig at være modtagelige for E. faecalis blærebetændelse. Disse repræsentative modeller bliver brugt til at få markante nye indsigter i patogenesen af ​​UTI sygdom, der fører til udvikling af nye lægemidler og ledelse eller forebyggelsesstrategier.

Introduction

Urinvejsinfektioner (UVI) er en af ​​de mest almindelige bakterielle infektioner, og kan opdeles i to kategorier baseret på den mekanisme af erhvervelse, fællesskab og nosokomiel erhvervet UTI. Erhvervet uden urinvejsinfektioner ofte forekommer i ellers raske kvinder og undersøgelser har vist, at ca. 50% af kvinder vil have mindst én UTI i deres levetid ^1. Derudover gentagelse er et stort problem. En kvinde, der har en indledende akut infektion har en 25-40% chance for at få en anden infektion inden for seks måneder på trods af passende antibiotisk behandling og mange kvinder fortsat har hyppige gentagelser ^2. De bakterier, der forårsager disse infektioner er også stadig mere antibiotikaresistente yderligere forstyrrende behandlingsprotokoller ^3-6. UTI påvirke millioner af enkeltpersoner hvert år koster cirka 2,5 milliarder dollars i sundhedspleje relaterede udgifter i USA, understreger virkningen og forekomsten af ​​sygdommen1,7 .Nosocomial erhvervede urinvejsinfektioner er hovedsageligt forbundet med tilstedeværelsen af udenlandske organer såsom indlagte katetre. Kateter-associeret urinvejsinfektioner (CAUTI) fortsat den mest almindelige nosokomielle erhvervet UTI, der tegner sig for ~ 70-80% af sådanne infektioner ^8. Endvidere er CAUTI forbundet med øget sygelighed og dødelighed, og det er den mest almindelige årsag til sekundære blodbanen infektioner ^9.

UPEC associeret nosocomiel urinvejsinfektioner menes at være forårsaget af indførelsen af bakterier i blæren fra reservoirer i mavetarmkanalen via mekanisk manipulation under samleje, dårlig hygiejne eller andre mikrobielle populationsdynamik mellem forskellige vært nicher ^10. Når du er inde i blæren, UPEC ansætte mange virulensfaktorer, herunder kapsel, erhvervelse jern systemer, toksiner, en virulensplasmid, tRNA'er, sygdomsfremkaldende evne øer og kolonisering faktorer, der har vist sig at spille en rolle i patogenesen <sup> 11-14. Afgørende for etableringen af UPEC kolonisering, UPEC også kode flere typer af selvklæbende chaperone indvarsle vejen (CUP) pili, der genkender receptorer med stereokemiske specificitet ^15. Type 1 pili, tippet med FimH adhæsinet, udtrykkes af UPEC og binder mannosyleret uroplakins ¹⁶ og α-1, β-3 integriner ^17, som er udtrykt på den luminale overflade af både menneskelige og mus blærer ^18. Disse FimH-medierede interaktioner lette bakteriel kolonisering og invasion af de overfladiske epitelceller ^19,20. Inde i cellen, kan UPEC undslippe ind i cytoplasmaet, hvor en enkelt bakterie kan hurtigt opdele til dannelse af en intracellulær bakteriel samfund (IBC), som ved modning, kan indeholde ~ 10 ⁴ bakterier ^21. IBC-dannelse er blevet påvist i mindst seks forskellige musestammer, C3H / HeN, C3H / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ og BALB / c, og med en lang række forskellige UPEC-stammer og andre Enterobacteriaceae ^22-24. Men tidsmæssige og rumlige forskelle IBC-dannelse kan variere afhængigt af muse baggrund og den inficerende UPEC stamme. I C3H / HeN mus inficeret med den prototypiske UPEC stammerne UTI89 eller CFT073, IBC-dannelse kan visualiseres som små biomasser af bakterier så tidligt som 3 hpi (timer efter infektion). Dette fællesskab fortsætter med at udvide og når et "midtpunkt" af udviklingen ca. 6 hpi når stavformede bakterier optager en stor procentdel af det cytoplasmatiske rum af terminalt differentierede overfladiske paraply celler Disse tidlige IBC form i en forholdsvis synkron måde med de fleste viser lignende dimensioner og morfologier. ~ 8 hpi bakterierne i IBC ændringen fra en baciller til cocci morfologi. IBC er forbigående. Således IBC modning 12-18 HPI resulterer i fortsat udbygning af den bakterielle population, efterfulgt af deres filamentering og spredning ud af cellen with efterfølgende spredning til omkringliggende celler ^23. Således IBC niche tillader hurtig bakteriel vækst i et miljø beskyttet mod værtens immunrespons og antibiotika ^25. De forskellige stadier af UPEC infektion, der er set i mus er også observeret i mennesker, såsom IBC'er og filamentering, støtter musemodel for UTI som en gavnlig værktøj, der kan bruges til at modellere UTI hos mennesker ^22,26-28.

Mens et flertal af kvinder oplever en UTI i deres liv, kan udfaldet af disse infektioner spænder fra akut selvbegrænsende infektion med ingen gentagelse, at hyppige tilbagevendende blærebetændelse. Endvidere har undersøgelser vist en stærk familiær forekomst af UTI, hvilket tyder på en genetisk komponent bidrager til UTI modtagelighed ^29. Vi har fundet, at de forskellige UTI resultater set i klinikker kan spejles af de forskellige resultater af eksperimentel UPEC smitte blandt indavlede musestammer ^30. F.eks C3H / høne, CBA, DBA, og C3H / HeOuJ mus er modtagelige, i en infektiøs dosis-afhængig måde, at langvarig, kronisk cystitis karakteriseret ved vedvarende, høj titer bakterier (> 10 ⁴ kolonidannende enheder (CFU) / ml), høj titer bakterielle blære byrder på offer> 4 uger efter infektion (WPI), kronisk inflammation og urotelial nekrose. Disse mus viser også forhøjede serumniveauer af IL-6, G-CSF, KC, og IL-5 inden for den første 24 hpi, der tjener som biomarkører for udvikling af kronisk blærebetændelse. Dette kan nøjagtigt repræsentere det naturlige forløb af UTI hos nogle kvinder, som placebo undersøgelser har vist, at en stor procentdel af kvinder oplever UTI bevarer høje niveauer af bakterier i deres urin i flere uger efter de første symptomer på blærebetændelse, hvis ikke givet antibiotisk behandling ^{31 , 32.} Endvidere bruger C3H / HeN mus, fandt vi, at en historie af kronisk blærebetændelse er en væsentlig risikofaktor for efterfølgende svære tilbagevendende infektioner. Tilbagevendende UTI er det mest significant kliniske manifestation af UTI og C3H / høne mus er i øjeblikket den eneste undersøgte model, der rekapitulerer en øget disposition efter tidligere eksponering. En anden UTI resultatet er sammenfattet i C57BL / 6 mus, hvor akut UPEC infektion er selvbegrænsende, med opløsning på blære betændelse og bakteriuri inden for ca. en uge. Interessant i denne model, UPEC danner let hvilende intracellulære -reservoirer i blæren væv, hvorfra UPEC er i stand til at opstå fra en hvilende tilstand til reinitiere en aktiv UTI, potentielt forklare en mekanisme til samme stamme tilbagevendende UTI hos mennesker ^{33, 34.}

Ud over genetiske indflydelser på UTI modtagelighed, indføring af et kateter i blæren øger sandsynligheden for at have en infektion samt øge udvalget af bakterier i stand til at forårsage en infektion. Det er blevet påvist, at human urin kateterisation forårsager histologiske ogimmunologiske forandringer i blæren på grund af mekanisk belastning, der resulterer i en robust inflammatorisk respons, delaminering, ødemer i lamina propria og submucusa, urotelial udtynding, og mucosale læsion i urinvejene og nyrer ^35,36. Derudover kateteret tilvejebringer en overflade for bakteriel fastgørelse derved skabe et miljø udnyttet af flere arter at forårsage CAUTI. Mens UPEC er stadig en vigtig bidragyder, Enterococcus faecalis tegner sig for 15% af disse CAUTI ^37. E. faecalis bliver mere og mere resistente over for antibiotika med vancomycinresistens fremkomst, hvilket udgør en alvorlig sundhedsmæssig bekymring ^38. E. faecalis besidder mange virulensfaktorer, herunder toksiner og adhæsiner er nødvendige til fastgørelse til både kateteret og epitel ^38. Under urin kateterisation, værten er sårbar over for mikrobiel vedhæftning, formering og spredning i urinvejene ^39,40. E. faecalis danner en biofilm på kateteret som del af en mekanisme til at forblive i blæren og formidle til nyrerne, som er gengivet i en mus CAUTI model ^41. For nylig er det blevet vist under blærekateterisation er fibrinogen (Fg) udsættes i blæren som en del af den inflammatoriske respons. Fg akkumuleres i blæren, frakker kateteret og er essentiel for E. faecalis biofilm dannelse, der fungerer som en vedhæftet fil stillads. I en C57BL / 6 musemodel for CAUTI, opdagede vi, at E. faecalis biofilmdannelse på katetret, og således persistens i blæren, var afhængig af EBP pilus, specielt dens spids adhæsin EbpA. Vi fandt, at det N-terminale domæne af EbpA specifikt binder til Fg-belægning af kateteret. Derudover blev det fundet, at E. faecalis udnytter Fg som metabolit kilde under infektion og dermed øge biofilmdannelse ^42.

Musemodeller har vist sig afgørende for understanding samt forudsige kliniske manifestationer af UTI og CAUTI ^41. I denne artikel demonstrerer vi forberedelse af blærebetændelse UPEC inokulum isolere UTI89 og transuretral podning af C3H / HeN mus. Derudover viser vi en protokol for kateter indsætning i C57BL / 6-mus og inokulering af E. faecalis OG1RF stamme. Begge disse teknikker fører til konsekvent og pålidelig UTI eller CAUTI i mus. Vi viser også teknikker, der anvendes til at observere IBC dannelse under akut blærebetændelse og urinopsamling til analyse af kroniske eller tilbagevendende blærebetændelse. C3H / HeN mus er blevet anvendt til at undersøge aspekter af UPEC patogenese herunder indledende bakteriel invasion, IBC dannelse, filamentering og udvikling af kronisk blærebetændelse ^23,33,43. Disse virulens parametre er også blevet undersøgt i en række andre mus baggrunde ^22,33. For CAUTI, C57BL / 6-modellen giver mulighed for fremmedlegeme implantation i blæren med efterfølgende bakteriel colonization, som kan opretholdes i 7 dage efter infektion ^41. Disse modeller har været nyttige for vurderingen af ​​bakteriel virulens mekanismer, host reaktioner på UTI og mekanismer at undergrave vært reaktioner, hvoraf meget er efterfølgende gengivet eller observeret i kliniske befolkningsgrupper.

Protocol

Etik erklæring: The Washington University Animal Studies Udvalget godkendte alle mus infektioner og procedurer som led i protokol nummer 20120216, der blev godkendt 2013/01/11 og udløber 2016/01/11. Samlet pasning af dyrene var i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr fra National Research Council og USDA Animal Care Resource Guide. Eutanasi procedurer er i overensstemmelse med de "AVMA retningslinjer for aflivning af dyr 2013 udgave." 1. UPEC UT…

Representative Results

De intravesikale modeller for ukompliceret og kateter forbundet UTI giver fleksible platforme for at belyse de molekylære mekanismer i bakteriel patogenese, virkningen af ​​disse sygdomme på værtsvævet, samt udvikling og afprøvning af nye tilgange til at håndtere disse fælles og dyre infektioner. Afhængigt af musestamme og patogen, kan intravesikal podning anvendes til at studere vært-patogen vekselvirkninger at belyse faktorer, der er nødvendige for at iværksætte eller modulering akutte (figur 1…

Discussion

Ukompliceret erhvervet uden UTI er en almindelig og dyrt infektion tegner sig for flere millioner primær pleje besøg hvert år ^46. Desuden Cautis er et fælles sundhedsvæsen erhvervet infektion, der er blevet ekstremt dyrt at leverandører af sundhedsydelser som Centers for Medicare og Medicaid Services ikke længere refunderer udbydere for den ekstra udgifter til behandling som følge af hospitalet erhvervet CAUTI ^45. De musemodeller for UTI, både ukompliceret blærebetændelse og CAUTI, der e…

Materials

Material for catheter and needle preparation:
30ga needles	BD Precision Glide	305106	30Gx ½ (0.3 mm x 13mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 mL
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs – Stainless Steel – Large Capacity –
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 in
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 in x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1X Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299