Oprichting en karakterisering van UTI en Cauti in een muismodel

Summary

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Abstract

Urineweginfecties (UTI) een hoge prevalentie, een belangrijke oorzaak van morbiditeit en steeds resistent zijn tegen behandeling met antibiotica. Vrouwtjes worden onevenredig getroffen door UTI: 50% van alle vrouwen zal een UTI in hun leven hebben. Bovendien, 20-40% van de vrouwen die een eerste UTI zal een herhaling met enkele lijden frequente recidieven met een ernstige verslechtering van de kwaliteit van leven, pijn en ongemak, verstoring van de dagelijkse activiteiten te lijden, toegenomen kosten van de gezondheidszorg, en weinig behandelingsopties andere dan op lange termijn antibiotica profylaxe. Uropathogene Escherichia coli (UPEC) is de belangrijkste verwekker van de gemeenschap verworven UTI. Katheter geassocieerd UTI (Cauti) is de meest voorkomende ziekenhuis verworven infectie goed voor een miljoen exemplaren in de VS jaarlijks en dramatische kosten van de gezondheidszorg. Terwijl UPEC is de primaire oorzaak van Cauti andere veroorzakers zijn van toegenomen belang zoals Enterococcusfaecalis. Hier gebruiken we twee gevestigde muismodellen dat veel van de klinische karakteristieken van deze menselijke ziekten recapituleren. Voor UTI, een C3H / HeN model recapituleert veel van de functies van UPEC virulentie waargenomen bij de mens, waaronder gastheer reacties, IBC vorming en filamentatie. Voor Cauti een model gebruikt C57BL / 6 muizen, die catheter blaas implantaten behouden, is gevoelig te zijn E. faecalis blaasontsteking. Deze representatieve modellen worden gebruikt om opvallende nieuwe inzichten in de pathogenese van de ziekte UTI, wat leidt tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische en beheer of preventiestrategieën.

Introduction

Urineweginfecties (UWI) zijn één van de meest voorkomende bacteriële infecties en kan worden onderverdeeld in twee categorieën op basis van het mechanisme van de overname, de gemeenschap en nosocomiale verworven UTI. Gemeenschap verworven UTIs vaak voor bij gezonde vrouwen en studies hebben aangetoond dat ongeveer 50% van de vrouwen minstens één UTI in hun leven ^1. Bovendien herhaling is een groot probleem. Een vrouw die een eerste acute infectie heeft, heeft een 25-40% kans op een tweede infectie binnen zes maanden, ondanks de juiste behandeling met antibiotica en veel vrouwen blijven frequente recidieven ² hebben. De bacteriën die deze infecties worden steeds antibioticaresistente verdere verstorende behandelingsprotocollen ^3-6. UTI invloed miljoenen mensen per jaar kost ongeveer 2,5 miljard dollar in de gezondheidszorg gerelateerde kosten in de VS, het benadrukken van de impact en de prevalentie van de ziekte1,7 .Nosocomial verworven urineweginfecties zijn vooral geassocieerd met de aanwezigheid van buitenlandse instanties, zoals inwonende katheters. Katheter geassocieerde urineweginfecties (Cauti) blijven de meest voorkomende nosocomiale UTI verworven, goed voor ~ 70-80% van dergelijke infecties ^8. Bovendien Cauti is geassocieerd met verhoogde morbiditeit en mortaliteit en het is de meest voorkomende oorzaak van secundaire infecties bloedbaan ^9.

UPEC geassocieerd gemeenschap verworven urineweginfecties zijn gedacht te worden veroorzaakt door de introductie van bacteriën in de blaas van reservoirs in het maagdarmkanaal via mechanische manipulatie tijdens de geslachtsgemeenschap, slechte hygiëne of andere microbiële populatiedynamiek tussen verschillende gastheer niches ^10. Eenmaal in de blaas, UPEC gebruik talrijke virulentiefactoren, zoals capsule, iron acquisition systems, toxinen, een virulentie plasmide, tRNAs, pathogeniteit eilanden en kolonisatie factoren waarvan is aangetoond een rol te spelen in de pathogenese <sup> 11-14. Van cruciaal belang voor de oprichting van UPEC kolonisatie, UPEC ook coderen meerdere soorten lijm chaperone Usher pathway (CUP) pili dat receptoren met stereo- specificiteit ¹⁵ herkennen. Type 1 pili, gaven de adhesine FimH, worden uitgedrukt door UPEC en binden gemannosyleerd uroplakins ¹⁶ en α-1, β-3 integrines ^17, die zijn uitgedrukt op het luminale oppervlak van zowel mens en muis blazen ^18. Deze FimH-gemedieerde interacties bevorderen bacteriële kolonisatie en invasie van de oppervlakkige epitheelcellen ^19,20. Eenmaal in de cel kan UPEC ontsnappen in het cytoplasma, waar een bacterie snel kan verdelen om een intracellulaire bacteriële gemeenschappen (IBC), die bij rijping kan 10 ⁴ bacteriën bevatten ²¹ ~ vormen. IBC formatie is aangetoond in ten minste zes verschillende muizenstammen, C3H / HeN, C3H / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ en BALB / c, en met een groot aantal verschillende UPEC stammen en andere Enterobacteriaceae ^22-24. Maar in tijd en ruimte verschillen IBC vorming kan variëren afhankelijk van de muis achtergrond en de infecterende UPEC-stam. In C3H / HeN muizen geïnfecteerd met de prototypische UPEC stammen UTI89 of CFT073, IBC formatie kan worden gevisualiseerd als kleine biomassa bacteriën zo vroeg als 3 hpi (uur na infectie). Deze gemeenschap blijft groeien en bereikt een "middelpunt" van het complex op ongeveer 6 HPI wanneer de staafvormige bacterie nemen een groot percentage van de cytoplasmatische ruimte van terminaal gedifferentieerde cellen oppervlakkige paraplu Deze vroege IBC vorm relatief synchrone wijze met de meeste vergelijkbare afmetingen tonen en morfologie. ~ 8 hpi de bacteriën in de IBC overgang van een bacillen morfologie kokken. IBC's zijn van voorbijgaande aard. Aldus IBC rijping 12-18 HPI resultaten in verdere expansie van de bacteriële populatie, gevolgd door hun filamentatie en dispersie uit de cel with daaropvolgende verspreiding naar naburige cellen ^23. Zo is de IBC niche zorgt voor een snelle bacteriegroei in een omgeving beschermd tegen gastheer immuunreacties en antibiotica ^25. De verschillende stadia van UPEC infectie die wordt waargenomen bij muizen zijn ook waargenomen bij mensen, zoals IBC en filamentatie, ondersteunen het muizenmodel van UTI als een voordelig instrument dat kan worden gemodelleerd UTI bij mensen ^22,26-28.

Terwijl een meerderheid van de vrouwen ervaren een UTI in hun leven, kan de uitkomst van deze infecties variëren van acute zelfbeperkende infectie met geen recidief, frequent terugkerende blaasontsteking. Verder hebben studies aangetoond een sterk familiair voorkomen van UTI, hetgeen duidt op een genetische component bijdraagt ​​aan UTI gevoeligheid ^29. We hebben ontdekt dat de verschillende UTI uitkomsten gezien in klinieken kan worden weerspiegeld door de verschillende uitkomsten van experimentele UPEC infectie onder inteelt muizenstammen ^30. Bijvoorbeeld, C3H / HeN, CBA, DBA, en C3H / HeOuJ muizen gevoelig, in een infectueuze dosis-afhankelijke manier, om langdurige, chronische cystitis gekenmerkt door aanhoudende, hoge titer bacteriën (> 10 ⁴ kolonievormende eenheden (CFU) / ml), hoge titer bacteriële blaas lasten op offer> 4 weken na infectie (WPI), chronische ontsteking, en urotheliale necrose. Deze muizen ook worden weergegeven verhoogde serumniveaus van IL-6, G-CSF, KC en IL-5 in de eerste 24 HPI die dienen als biomarkers voor de ontwikkeling van chronische cystitis. Dit kan goed mogelijk de natuurlijke loop van UTI vertegenwoordigen bij sommige vrouwen, placebo studies hebben aangetoond dat een groot percentage van de vrouwen die UTI zal hoge bacteriën in hun urine handhaven gedurende enkele weken na de eerste symptomen van blaasontsteking indien niet gegeven antibiotica ^{31 , 32.} Verder gebruik C3H / HeN muizen, vonden we dat een geschiedenis van chronische cystitis is een belangrijke risicofactor voor de volgende ernstige terugkerende infecties. Terugkerende UTI is de meest significant klinische manifestatie van UTI en de C3H / HeN muis is momenteel de enige bestudeerde model dat een verhoogde aanleg na eerdere blootstelling recapituleert. Een tweede UTI uitkomst wordt gerecapituleerd in C57BL / 6 muizen, waar acute UPEC infectie zelfbeperkend, met een resolutie van de blaas ontsteking en bacteriurie binnen ongeveer een week. Interessant is dat in dit model, UPEC vormen gemakkelijk rustende intracellulaire reservoirs binnen de blaas weefsel waarvan UPEC in staat zijn die uit een slapende toestand naar een actieve UTI hervatten, eventueel verklaren één mechanisme voor dezelfde stam terugkerende UTI bij mensen ^{33, 34.}

Naast de genetische invloeden op UTI gevoeligheid, invoering van een katheter in de blaas verhoogt de kans op een infectie en verhoogt het bereik van bacteriën in staat om een ​​infectie te veroorzaken. Er is aangetoond dat menselijke Blaaskatheterisatie veroorzaakt histologische enimmunologische veranderingen in de blaas door mechanische stress die resulteert in een sterke ontstekingsreactie, afschilfering, oedeem van de lamina propria en submucusa, urotheel dunner en mucosale laesie van het urotheel en nieren ^35,36. Bovendien, de katheter een oppervlaktebescherming voor bacteriële hechting zo een omgeving gebruiken Verscheidene soorten Cauti veroorzaken creëren. Terwijl UPEC zijn nog steeds een belangrijke bijdrage, Enterococcus faecalis is goed voor 15% van deze Cauti ^37. E. faecalis wordt steeds meer resistent tegen antibiotica met vancomycine weerstand ontstaan, die een ernstig gezondheidsprobleem zorg ^38. E. faecalis bezitten vele virulentiefactoren zoals toxinen en adhesinen nodig zijn voor bevestiging aan zowel de katheter en epithelium ^38. Tijdens Blaaskatheterisatie is de gastheer gevoelig voor microbiële hechting, vermenigvuldigen en verspreiden in de urinewegen ^39,40. E. faecalis vormen een biofilm op de katheter als onderdeel van een mechanisme te volharden in de blaas en verspreidt onder de nieren, is weergegeven in een muis ⁴¹ model Cauti. Recentelijk is aangetoond tijdens Blaaskatheterisatie wordt fibrinogeen (Fg) vrij in de blaas als onderdeel van de ontstekingsreactie. Fg accumuleert in de blaas, bedekt de catheter en is essentieel voor E. faecalis biofilm vorming, functioneren als een bijlage schavot. In een C57BL / 6 muis-model van Cauti, dat ontdekten we E. faecalis biofilm vorming op de katheter, en derhalve persistentie in de blaas, afhankelijk was van de Ebp pilus specifiek zijn punt adhesine EbpA. We vonden dat het N-terminale domein van EbpA specifiek bindt aan FG bekleden van de katheter. Bovendien werd gevonden dat E. faecalis gebruikt Fg als metaboliet bron tijdens infectie, waardoor het verbeteren biofilmvorming ^42.

Muismodellen hebben kritische bewezen understanding en voorspellen van klinische manifestaties van UTI en Cauti ^41. In dit artikel tonen we inoculum voorbereiding van de blaasontsteking UPEC isoleren UTI89 en transurethrale inoculatie van C3H / HeN muizen. Verder tonen we een protocol voor catheter inbrengen in C57BL / 6 muizen en inoculatie van de E. faecalis OG1RF stam. Beide technieken leiden tot consistente en betrouwbare UTI of Cauti bij muizen. We geven ook de technieken die worden gebruikt om de vorming van IBC observeren tijdens acute blaasontsteking en urine verzamelen voor de analyse van chronische of recidiverende blaasontsteking. C3H / HeN-muizen werden gebruikt om aspecten van UPEC pathogenese waaronder initiële bacteriële invasie, IBC vorming filamentatie en de ontwikkeling van chronische blaasontsteking ^23,33,43 bestuderen. Deze virulentie parameters zijn ook onderzocht bij een verscheidenheid van andere muizen achtergronden ^22,33. Voor Cauti, de C57BL / 6-model zorgt voor een vreemd lichaam implantatie in de blaas met daaropvolgende bacteriële colonization, die kan worden gehandhaafd gedurende 7 dagen na infectie ^41. Deze modellen zijn nuttig voor de beoordeling van bacteriële virulentie mechanismen, gastheer reacties op UTI en mechanismen om gastheer reacties, waarvan een groot deel is vervolgens recapituleerde of waargenomen in klinische menselijke bevolking ondermijnen geweest.

Protocol

Ethiek statement: De Rijksuniversiteit Animal Comité Studies Washington keurden alle muis infecties en procedures in het kader van het protocol nummer 20120216, dat werd goedgekeurd 2013/01/11 en verloopt 2016/01/11. Algehele verzorging van de dieren was in overeenstemming met de gids van de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Research Council en de USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasie procedures zijn in overeenstemming met de "AVMA richtlijnen voor de euthanasie van dieren 2013 editie." </…

Representative Results

De intravesicale modellen van ongecompliceerde en katheter geassocieerd UTI bieden flexibele platforms voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van bacteriële pathogenese, de impact van deze ziekten op host weefsel, en de ontwikkeling en het testen van nieuwe benaderingen van deze gemeenschappelijke en kostbare infecties te beheren. Afhankelijk van de muizenstam en ziekteverwekker, kunnen intravesicale inoculatie worden gebruikt om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen factoren voor het initiëren of m…

Discussion

Ongecompliceerde gemeenschap verworven UTI is een veel voorkomende en kostbare infectie goed voor enkele miljoenen eerstelijns gezondheidszorg bezoeken per jaar ^46. Daarnaast Cautis zijn een gemeenschappelijke zorg verworven infectie die zeer kostbaar om zorgverleners als de Centra van Medicare en Medicaid Services is geworden niet meer vergoedt providers voor de extra kosten van de behandeling als gevolg van het ziekenhuis verworven Cauti ^45. De muismodellen van UTI, zowel ongecompliceerde cystiti…

Materials

Material for catheter and needle preparation:
30ga needles	BD Precision Glide	305106	30Gx ½ (0.3 mm x 13mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 mL
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs – Stainless Steel – Large Capacity –
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 in
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 in x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1X Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299