ההקמה ואפיון של UTI וCAUTI במודל עכבר

Summary

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Abstract

זיהומים בדרכי שתן (UTI) הם נפוצים ביותר, גורם משמעותי לתחלואה והם עמידים יותר ויותר לטיפול באנטיביוטיקה. נקבות נגועות באופן לא פרופורציונאלי על ידי דלקת בדרכי שתן: 50% מכלל הנשים יהיו UTI בחייהם. בנוסף, 20-40% מהנשים האלה שיש להם דלקת בדרכי שתן ראשוני יסבלו הישנות עם כמה הישנויות תכופות הסובלות מהידרדרות חמורה באיכות חיים, כאב ואי נוחות, שיבוש של פעילויות יומיומיות, גדלו עלויות בריאות, וכמה אפשרויות טיפול אחרים מטיפול מונע באנטיביוטיקה לטווח ארוך. coli Uropathogenic Escherichia (UPEC) הוא הסוכן סיבתי העיקרי של קהילה רכש UTI. הדלקת בדרכי השתן הקשורים צנתר (CAUTI) הוא הזיהום השכיח ביותר בבית החולים רכשו היווה מיליון התרחשויות בארה"ב מדי שנה, ועלויות בריאות דרמטיות. בעוד UPEC הוא גם הגורם העיקרי לCAUTI, סוכני סיבה אחרים הם בעלי חשיבות מוגברת כוללים אנטרוקוקוסfaecalis. כאן אנו מנצלים שני מודלים עכבר מבוססים היטב כי לשחזר רב של המאפיינים הקליניים של מחלות בבני אדם אלה. לדלקת בדרכי שתן, מודל C3H / חן משחזר רב מהתכונות של אלימות UPEC נצפו בבני אדם ובכלל זה תגובות מארחות, היווצרות מבני תעשייה וfilamentation. לCAUTI, מודל באמצעות C57BL / 6 עכברים, אשר שומרים על שתלי שלפוחית ​​השתן קטטר, הוכח להיות רגיש לE. faecalis דלקת בשלפוחית ​​השתן. מודלים נציג אלה נמצאים בשימוש כדי להשיג תובנות חדשות בולטות לפתוגנזה של מחלה בדרכי שתן, שמובילה לפיתוח תרופות חדשניות ואסטרטגיות ניהול או מניעה.

Introduction

זיהומים בדרכי שתן (זיהומים בדרכי שתן) הם אחד הזיהומים חיידקיים הנפוצים ביותר וניתן לחלק לשתי קטגוריות המבוססות על המנגנון של רכישה, קהילה וnosocomial רכש UTI. זיהומים בדרכי השתן מתרחשים לעתים קרובות בנשים ומחקרים בריאים נרכשה בקהילה הראה כי כ -50% מהנשים יהיו לפחות אחד UTI בחייהם ^1. בנוסף, הישנות היא בעיה עיקרית. יש אישה שיש הדבקה ראשונית סיכוי 25-40% שיש לו זיהום שני בתוך שישה חודשים למרות טיפול אנטיביוטי מתאים, ונשים רבות ממשיכים להיות הישנויות תכופות ^2. החיידקים הגורמים לזיהומים אלה גם הופכים יותר ויותר עמידים לאנטיביוטיקה פרוטוקולים נוספים של בלבול טיפול ^3-6. דלקת בדרכי השתן משפיעים על מיליוני אנשים בכל שנה עולים כ -2.5 מליארד דולרים בהוצאות הקשורות בריאות בארה"ב, מה שמדגיש את ההשפעה והשכיחות של המחלה1,7 .Nosocomial רכש זיהומים בדרכי שתן קשורים בעיקר עם הנוכחות של גופים זרים כגון צנתרים שכינה. הזיהומים בדרכי השתן הקשורים צנתר (CAUTI) יישאר nosocomial הנפוץ ביותר רכש UTI, והיוו ~ 70-80% מזיהומים כגון ^8. יתר על כן, CAUTI קשור עם תחלואה ותמותה מוגברות וזה הגורם הנפוץ ביותר לזיהומים בדם משניים ^9.

הקהילה קשורה UPEC רכשה זיהומים בדרכי השתן הם חשבו להיגרם על ידי ההקדמה של חיידקים לשלפוחית ​​השתן ממאגרים במערכת העיכול באמצעות מניפולציה מכאנית במהלך קיום יחסי מין, היגיינה הלקויה או דינמיקת אוכלוסיית חיידקים אחרת בין מארח שונה נישות ^10. ברגע שנכנס לשלפוחית ​​השתן, UPEC להעסיק גורמים ארסי רבים, כולל כמוסה, מערכות רכישת ברזל, רעלים, פלסמיד ארסיות, tRNAs, איי פתוגניות וגורמי התישבות שהוכחו לשחק תפקיד בפתוגנזה <sup> 11-14. קריטי להקמתה של התישבות UPEC, UPEC גם לקודד סוגים שונים של פילי מלווה דבק סדרן מסלול (CUP) שמכירים קולטנים עם סגוליות stereochemical ^15. פילים מסוג 1, הטו עם adhesin FimH, באים לידי הביטוי על ידי UPEC ולאגד mannosylated uroplakins ¹⁶ וα-1, β-3 integrins ^17, אשר באים לידי ביטוי על פני השטח luminal של שני שלפוחיות האדם ועכבר ^18. אינטראקציות בתיווך FimH אלה להקל קולוניזציה ופלישה של תאי האפיתל השטחיים ^19,20 חיידקים. פעם בתוך התא, UPEC יכול לברוח לתוך הציטופלסמה שבי חיידק בודד במהירות יכול לחלק ליצירת קהילה תאית חיידקים (IBC), אשר על התבגרות, יכול להכיל ~ 10 ⁴ חיידקים ^21. היווצרות IBC הודגמה בלפחות שישה זנים שונים עכבר, C3H / חן, C3H / HeJ, C57Bl / 6, CBA, FVB / ניו ג'רזי וBALB / ג, ועם מגוון רחב של UPE שונהזני C וEnterobacteriaceae ^22-24 אחר. עם זאת הבדלי זמן ומרחב של היווצרות IBC יכולים להשתנות בהתאם לרקע העכבר ומתח UPEC הדבקה. בC3H / עכברי חן נגועים בUPEC הטיפוסי זני UTI89 או היווצרות CFT073, IBC ניתן דמיינו כbiomasses הקטן של חיידקים מוקדם ככל 3 HPI (לאחר זיהום שעות). קהילה זו ממשיכה להתרחב ומגיעה "נקודת אמצע" של הפיתוח כ -6 HPI כאשר חיידקי המוט בצורה לכבוש אחוז גדול של מרחב cytoplasmic של תאי מטרייה שטחיים סופני הבדיל צורת IBCs המוקדם אלה באופן יחסי סינכרוני עם הרוב בו מוצגות ממדים דומים ומורפולוגיות. ~ 8 HPI החיידקים בשינוי IBC מחיידקים לCocci מורפולוגיה. IBCs הם בעלת האופי ארעי. לפיכך, התבגרות IBC 12-18 תוצאות HPI בהמשך ההתרחבות של אוכלוסיית החיידקים, ואחריו filamentation ופיזורם מחוץ לתא with התפשטות לאחר תאים שכנים ^23. כך, הנישה IBC מאפשרת התפתחות חיידקים מהירה בסביבה המוגנת מפני תגובה חיסונית מארח ואנטיביוטיקה ^25. השלבים שונים של זיהום UPEC כי הם ראו בעכברים גם הם נצפו בבני אדם, כגון IBCs וfilamentation, התומכים במודל העכבר של UTI ככלי מועיל שיכול לשמש מודל UTI בבני האדם ^22,26-28.

בעוד שרוב הנשים חווים UTI בחייהם, התוצאה של זיהומים אלה יכול לנוע בין זיהום הגבלה עצמית חריף ללא הישנות, לדלקת שלפוחית ​​השתן חוזרת ונשנית בתדירות גבוהה. יתר על כן, מחקרים הראו התרחשות משפחתית חזקה של דלקת בדרכי שתן, המצביע על מרכיב גנטי תורם לרגישות UTI ^29. מצאנו כי תוצאות UTI השונות ראו במרפאות יכולות להיות שיקוף על ידי התוצאות השונות של זיהום UPEC הניסיוני בין זנים טהורים עכבר ^30. לדוגמא, C3H / חן, CBA, עכברי DBA, וC3H / HeOuJ רגישים, באופן תלוי מינון זיהומיות, לדלקת שלפוחית ​​השתן לטווח ארוך, כרונית המאופיין על ידי חיידקים מתמשכים, גבוהים כייל (> 10 ⁴ יחידות מושבה להרכיב (CFU) / מיליליטר), חיידקים גבוה כייל נטל שלפוחית ​​השתן בהקרבה> 4 שבועות לאחר זיהום (WPI), דלקת כרונית, ונמק urothelial. עכברים אלה גם להציג רמות גבוהות בסרום של IL-6, G-CSF, KC, וIL-5 בתוך 24 HPI הראשון המשמשות כסמנים ביולוגיים להתפתחות דלקת שלפוחית ​​השתן כרונית. זה עשוי לייצג במדויק את המהלך הטבעי של דלקת בדרכי שתן בנשים מסוימות, כמו מחקרי פלצבו הראו כי אחוז גדול של נשים חווים UTI ישמור על רמות גבוהות של חיידקים בשתן שלהם במשך כמה שבועות לאחר התסמינים הראשונים של דלקת שלפוחית ​​השתן אם לא ניתן טיפול אנטיביוטי ^{31 , 32.} יתר על כן, שימוש בעכברי C3H / חן, מצאנו כי היסטוריה של דלקת שלפוחית ​​השתן כרונית מהווה גורם סיכון משמעותי לזיהומים חוזרים ונשנים חמורים שלאחר מכן. חוזר ונשנה בדרכי השתן הוא הכי siביטוי קליני gnificant של UTI ועכבר C3H / חן הוא כיום המודל למד רק שמשחזר נטייה מוגברת לאחר החשיפה קודמת. תוצאת UTI שנייה סכמה בC57Bl / 6 עכברים שבו זיהום UPEC החריף הוא הגבלה עצמית, עם רזולוציה של דלקת שלפוחית ​​השתן ובקטרוריה בתוך כשבוע. מעניין לציין, במודל זה, UPEC ליצור בקלות מאגרים תאיים שקטים בתוך רקמת שלפוחית ​​השתן ממנו UPEC מסוגל מתעורר ממצב רדום כדי לחדש את UTI פעיל, שעלול להסביר מנגנון אחד לדלקת בדרכי שתן חוזר אותו זן בבני אדם ^{33, 34.}

בנוסף להשפעות גנטיות על רגישות UTI, הקדמה של קטטר לשלפוחית ​​השתן מגדילה מאוד את הסיכוי שיש זיהום, כמו גם להגדיל את הטווח של חיידקים מסוגלים לגרום לזיהום. הוכח כי צנתור שתן אנושי גורם היסטולוגית ושינויים חיסוניים בשלפוחית ​​עקב לחץ מכאני שגורם לתגובה דלקתית חזקה, קילוף, בצקת של propria lamina וsubmucusa, הדליל urothelial, ונגע ברירית של urothelium וכליות ^35,36. בנוסף, קטטר מספק משטח לקובץ מצורף חיידקים ובכך ליצור סביבה מנוצלת על ידי כמה מינים לגרום CAUTI. בעוד UPEC עדיין תורם רב, אנטרוקוקוס faecalis מהווה 15% מCAUTI אלה ^37. א faecalis הופך עמיד יותר ויותר לאנטיביוטיקה עם vancomycin הופעת התנגדות, שהתחזה לדאגה בריאותית רצינית ^38. א faecalis להחזיק גורמים ארסי רבים, כולל רעלים וadhesins הכרחי לקובץ מצורף לשני קטטר ואפיתל ^38. במהלך צנתור שתן, המארח הוא פגיע להידבקות של חיידקים, כפל והפצה ^ב39,40 בדרכי השתן. א faecaליס יוצר biofilm על קטטר כחלק ממנגנון להתמיד בשלפוחית ​​השתן ולהפיץ לכליות, אשר הוא לשחזר במודל עכבר CAUTI ^41. לאחרונה, זה הוכח במהלך צנתור שתן, פיברינוגן (FG) הוא שוחרר לתוך שלפוחית ​​השתן כחלק מהתגובה הדלקתית. FG מצטבר בשלפוחית ​​השתן, מעילי קטטר וחיוני לE. faecalis היווצרות biofilm, מתפקד כפיגום מצורף. במודל C57BL / 6 עכבר של CAUTI, גילה שE. היווצרות faecalis biofilm על קטטר, ובכך ההתמדה בשלפוחית ​​השתן, הייתה תלוי בpilus EBP, במיוחד EbpA adhesin קצהו. מצאנו כי תחום N- המסוף של EbpA נקשר במיוחד לFG ציפוי קטטר. בנוסף, נמצא כי א faecalis מנצל FG כמקור המטבוליט במהלך זיהום, וכך לשפר את היווצרות biofilm ^42.

מודלים של העכברים הוכיחו קריטיים לאחורייםtanding כמו גם חיזוי הקליני של דלקת בדרכי השתן וCAUTI ^41. במאמר זה אנו מדגימים הכנת הבידוד של דלקת שלפוחית ​​השתן UPEC לבודד UTI89 וחיסון של עכברים דרך השופכה C3H / חן. בנוסף, אנחנו מדגימים פרוטוקול להכנסה קטטר בעכברי C57BL / 6 וחיסון של א ' זן faecalis OG1RF. שתי טכניקות אלו להוביל לדלקת בדרכי שתן עקבית ואמינים או CAUTI בעכברים. אנחנו גם להציג טכניקות המשמשות להתבונן היווצרות IBC בדלקת שלפוחית ​​השתן חריפה ואיסוף שתן לניתוח דלקת שלפוחית ​​השתן כרוני או חוזר ונשנה. עכברי C3H / חן שימשו ללמוד היבטים של הפתוגנזה UPEC כולל פלישה ראשונית חיידקים, היווצרות IBC, filamentation והפיתוח של דלקת שלפוחית ​​השתן כרוני ^23,33,43. פרמטרים אלה גם ארסיות נחקרו במגוון רחב של רקעי עכבר אחרים ^22,33. לCAUTI, C57BL / 6 המודל מאפשר להשתלת גוף זרה לתוך שלפוחית ​​השתן עם עמיתי חיידקים הבאיםlonization, שיכול להישמר במשך 7 ימים לאחר הזיהום ^41. מודלים אלה היו שימושיים להערכת מנגנוני אלימות של חיידקים, תגובות מארחות לדלקת בדרכי השתן ומנגנונים לערער תגובות מארחות, הרבה מהם כבר סכמו או שנצפו באוכלוסיות אנושיות קליניות לאחר מכן.

Protocol

הצהרת אתיקה: ועדת בעלי החיים באוניברסיטת וושינגטון המחקרים אישרה את כל זיהומי העכבר ונהלים כחלק מפרוטוקול מספר 20120216, אשר אושר על 2013/01/11 ויפוג 2016/01/11. טיפול כולל של בעלי החיים היה בקנה אחד עם הוראות לטיפול ושימוש בחי המעבדה מהמועצה הלאומית למחקר וטיפול במשאבי מדריך משר…

Representative Results

המודלים השלפוחית ​​של UTI קשור מסובך וקטטר לספק פלטפורמות גמישות להבהרת המנגנונים המולקולריים של פתוגנזה של חיידקים, ההשפעה של מחלות אלה ברקמת מארח, והפיתוח ובדיקות של גישות חדשות לניהול הזיהומים הנפוצים ויקרים הללו. בהתאם לזן העכבר והפתוגן, חיסון שלפוחית ​​יכול ל…

Discussion

הקהילה מסובכת רכשה UTI הוא זיהום שכיח ויקר והיוו כמה מיליוני ביקורי טיפול ראשוני בכל שנה ^46. בנוסף, Cautis הוא זיהום שנרכש בריאות משותפת שהפך יקר מאוד לספקי שירותי בריאות כמרכזים רפואיים Medicaid Services כבר לא משיב לספקי העלות הנוספת של טיפול וכתוצאה מבית החולים רכשו CAUTI <su…

Materials

Material for catheter and needle preparation:
30ga needles	BD Precision Glide	305106	30Gx ½ (0.3 mm x 13mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 mL
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs – Stainless Steel – Large Capacity –
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 in
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 in x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1X Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299