Upprättande och karakterisering av UTI och CAUTI i en musmodell

Summary

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Abstract

Urinvägsinfektioner (UVI) är mycket vanliga, en viktig orsak till sjuklighet och blir alltmer resistenta mot behandling med antibiotika. Kvinnor är oproportionerligt drabbas av urinvägsinfektion: 50% av alla kvinnor kommer att ha en urinvägsinfektion under sin livstid. Dessutom 20-40% av dessa kvinnor som har en initial UVI kommer att drabbas av återfall med vissa lider täta återfall med allvarlig försämring av livskvaliteten, smärta och obehag, störningar i den dagliga verksamheten, ökade sjukvårdskostnader, och några behandlingsalternativ andra än långtidsantibiotikaprofylax. Uropatogena Escherichia coli (UPEC) är den primära smittämnen av samhällsförvärvad UVI. Kateter-associerad UTI (CAUTI) är den vanligaste vårdrelaterade infektioner står för en miljon förekomster i USA årligen och dramatiska sjukvårdskostnader. Medan UPEC är också den främsta orsaken till CAUTI, andra orsakande medel är av ökad betydelse inklusive Enterococcusfaecalis. Här använder vi två väletablerade musmodeller som rekapitulera många av de kliniska egenskaperna hos dessa mänskliga sjukdomar. För UTI, rekapitulerar en C3H / HeN modell många av funktionerna i UPEC virulens observerats hos människor inklusive värdsvar, IBC formation och filamentation. För CAUTI, en modell med C57BL / 6-möss, som behåller kateter blåsa implantat, har visat sig vara känsliga för E. faecalis urinvägsinfektion. Dessa representativa modeller som används för att få slående nya insikter i patogenesen av UTI sjukdom, vilket leder till utveckling av nya läkemedel och hantering eller förebyggande strategier.

Introduction

Urinvägsinfektioner (UVI) är en av de vanligaste bakteriella infektioner och kan delas in i två kategorier baserat på mekanismen för förvärvet, gemenskap och sjukhus förvärvade UVI. Samhällsförvärvad UTIs förekommer ofta i övrigt friska kvinnor och studier har visat att cirka 50% av kvinnorna kommer att ha minst en UTI under sin livstid ^1. Dessutom är återkommande ett stort problem. En kvinna som har en initial akut infektion har en chans 25-40% av att ha en andra infektion inom sex månader trots lämplig antibiotikabehandling och många kvinnor fortsätter att ha täta återfall ^2. De bakterier som orsakar dessa infektioner blir också allt antibiotikaresistenta ytterligare störande behandlingsprotokoll ^3-6. UTI påverkar miljontals människor varje år kostar omkring 2,5 miljarder dollar i vårdrelaterade kostnader i USA, vilket understryker effekten och förekomsten av sjukdomen1,7 .Nosocomial förvärvade urinvägsinfektioner är främst förknippade med förekomsten av främmande partiklar som kvarliggande katetrar. Kateter-associerad UVI (CAUTI) förblir den vanligaste sjukhus förvärvade UTI står för ~ 70-80% av sådana infektioner ^8. Vidare är CAUTI associerad med ökad sjuklighet och dödlighet, och det är den vanligaste orsaken till sekundära blodinfektioner ^9.

UPEC tillhörande samhällsförvärvad urinvägsinfektioner tros vara orsakad av införandet av bakterier i urinblåsan från reservoarer i mag-tarmkanalen via mekanisk manipulation under samlag, dålig hygien eller andra mikrobiella populationsdynamik mellan olika värd Nischer ^10. Väl inne i urinblåsan, UPEC anställa många virulensfaktorer, inklusive kapsel, järn förvärvssystem, toxiner, en virulensplasmiden, tRNA, patogenicitet öar och koloniseringsfaktorer som har visat sig spela en roll i patogenesen <sup> 11-14. Avgörande för fastställandet av UPEC kolonisering, UPEC kodar också flera typer av lim förkläde vaktmästare vägen (CUP) pili som känner igen receptorer med stereo specificitet ^15. Typ 1 pili, tippas med FimH adhesin, uttrycks av UPEC och binda mannosylated uroplakins ¹⁶ och α-1, β-3 integriner ^17, som uttrycks på den luminala ytan av både mänskliga och mus blåsor ^18. Dessa FimH-förmedlade interaktioner underlättar bakteriell kolonisering och invasionen av ytliga epitelceller ^19,20. Väl inne i cellen kan UPEC fly in i cytoplasman där en enda bakterie snabbt kan dela sig för att bilda en intracellulär bakteriesamhället (IBC), som vid mognad, kan innehålla ~ 10 ⁴ bakterier ^21. IBC bildning har visats i minst sex olika musstammar, C3H / HeN, C3H / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ och BALB / c, och med ett brett utbud av olika UPEC-stammar och andra Enterobacteriaceae ^22-24. Emellertid temporala och spatiala skillnader i IBC bildning kan variera beroende på den mus bakgrunden och den infekterande UPEC stammen. I C3H / HeN-möss infekterade med den prototypiska UPEC stammar UTI89 eller CFT073, IBC bildning kan visualiseras som små biomassor av bakterier så tidigt som 3 hpi (timmar efter infektion). Denna gemenskap fortsätter att expandera och når en "mittpunkt" utveckling cirka 6 hpi när stavformade bakterier upptar en stor del av den cytoplasmiska utrymmet terminalt differentierade ytliga paraplyceller Dessa tidiga IBC form i ett relativt synkroniserat sätt med de flesta visar liknande dimensioner och morfologier. ~ 8 HPI bakterierna i IBC förändringen från ett baciller till kocker morfologi. IBC-behållare är av övergående natur. Således IBC mognad 12-18 HPI resulterar i fortsatt expansion av bakteriepopulationen, följt av deras filamentation och spridning ut ur cellen with efterföljande spridning till angränsande celler ^23. Således tillåter IBC nisch för snabb bakterietillväxt i en miljö som är skyddad från värdens immunsvar och antibiotika ^25. De olika stadierna av UPEC infektion som syns i möss också observerats hos människa, såsom IBC-behållare och filamentering, stödja musmodell av UVI som ett fördelaktigt verktyg som kan användas för att modellera UTI hos människor ^22,26-28.

Medan en majoritet av kvinnor upplever en UTI under sin livstid, kan resultatet av dessa infektioner allt från akut självbegränsande infektion utan återfall, att täta återkommande blåskatarr. Vidare har studier visat en stark familjär förekomst av UTI, vilket tyder på en genetisk komponent bidrar till UTI känslighet ^29. Vi har funnit att de olika UTI resultat sett i kliniker kan speglas av de olika resultaten av experimentell UPEC infektion bland inavlade musstammar ^30. Till exempel, C3H / höna, CBA, DBA och C3H / HeOuJ möss är mottagliga, i en smittsam dosberoende sätt, till långvarig, kronisk cystit karaktäriseras av ihållande höga titer bakterier (> 10 ⁴ kolonibildande enheter (CFU) / ml), hög titer bakterie blås bördor på offer> 4 veckor efter infektion (WPI), kronisk inflammation och uroteliala nekros. Dessa möss uppvisar också förhöjda serumnivåer av IL-6, G-CSF, KC, och IL-5 i den första 24 hpi som fungerar som biomarkörer för utveckling av kronisk cystit. Detta kan noggrant representera det naturliga förloppet av UTI hos vissa kvinnor, som placebo studier har visat att en stor andel av kvinnor upplever UVI kommer att behålla höga nivåer av bakterier i urinen i flera veckor efter de första symptomen på cystit om det inte ges antibiotikabehandling ^{31 , 32.} Vidare använder C3H / HeN möss, fann vi att en historia av kronisk cystit är en betydande riskfaktor för senare allvarliga återkommande infektioner. Återkommande UTI är det mest significant klinisk manifestation av UTI och C3H / höna mus är för närvarande den enda studerade modellen som rekapitulerar en ökad benägenhet efter tidigare exponering. En andra UVI utfall rekapituleras i C57BL / 6 möss, där akut UPEC infektion är självbegränsande, med upplösning på inflammation i urinblåsan och bakteriuri inom cirka en vecka. Intressant i denna modell, UPEC bildar lätt vilande intracellulära reservoarer inom blåsvävnad från vilken UPEC har förmåga att fram från ett vilande tillstånd att återinitiera en aktiv UVI, potentiellt förklara en mekanism för samma stam återkommande UTI hos människor ^{33, 34.}

Förutom genetiska påverkan på UTI känslighet ökar införandet av en kateter i urinblåsan kraftigt sannolikheten för att ha en infektion samt öka utbudet av bakterier som kan orsaka en infektion. Det har visats att mänsklig urin kateterisering orsakar histologiska ochimmunologiska förändringar i urinblåsan på grund av mekaniska påkänningar som resulterar i en robust inflammatoriskt svar, peeling, ödem i lamina propria och submucusa, uroteliala gallring och mucosal skada av urotelium och njure ^35,36. Dessutom ger katetern en yta för bakteriell vidhäftning och därigenom skapa en miljö utnyttjas av flera arter för att orsaka CAUTI. Medan UPEC är fortfarande en viktig bidragsgivare, svarar Enterococcus faecalis för 15% av dessa CAUTI ^37. E. faecalis blir alltmer resistenta mot antibiotika med resistens mot vancomycin uppkomst, utgör ett allvarligt hälsoproblem ^38. E. faecalis har många virulensfaktorer inklusive toxiner och adhesiner som krävs för anslutning till både katetern och epitel ^38. Under urin kateterisering, är utsatta för mikrobiell adhesion, förökning och spridning i urinvägarna ^39,40 värden. E. faecalis bildar en biofilm på katetern som en del av en mekanism för att framhärda i urinblåsan och sprida till njurarna, som återges i en mus CAUTI modell ^41. Nyligen har det visat vid urin kateterisering, fibrinogen (Fg) som släpps in i blåsan som en del av det inflammatoriska svaret. Fg ackumuleras i blåsan, rockar katetern och är väsentlig för E. faecalis biofilmsbildning, som fungerar som en bilaga schavotten. I en C57BL / 6 musmodell av CAUTI, upptäckte vi att E. faecalis biofilmbildning på katetern, och sålunda persistens i blåsan, var beroende av EBP pilus, speciellt dess spets adhesin EBPA. Vi fann att den N-terminala domänen av EBPA specifikt binder till FG beläggning av katetern. Dessutom konstaterades det att E. faecalis använder Fg som metabolit källan under infektion, vilket ökar biofilm formation ^42.

Musmodeller har visat avgörande för understanding samt att förutsäga kliniska manifestationer av UTI och CAUTI ^41. I den här artikeln visar vi inokulat beredning av cystit UPEC isolera UTI89 och transuretral ympning av C3H / HeN möss. Dessutom visar vi ett protokoll för katetrar i C57BL / 6-möss och inokulering av E. faecalis OG1RF stam. Båda dessa tekniker leder till en konsekvent och pålitlig UVI eller CAUTI i möss. Vi visar också tekniker som används för att observera IBC formation under akut cystit och urinsamling för analys av kronisk eller återkommande blåskatarr. C3H / HeN-möss har använts för att studera aspekter av UPEC patogenes inklusive inledande bakteriell invasion, IBC bildning, filamentering och utveckling av kronisk cystit ^23,33,43. Dessa virulens parametrar har också undersökts i en rad andra mus bakgrunder ^22,33. För CAUTI tillåter C57BL / 6 modell för främmande kropp implantation i urinblåsan med efterföljande bakteriell samarbetelonization, som kan hållas i 7 dagar efter infektion ^41. Dessa modeller har varit användbar för att bedöma bakteriell virulens mekanismer, värd svar på UVI och mekanismer för att undergräva värdsvar, som till stor del har därefter sammanfattat eller observerats i kliniska befolkningsgrupper.

Protocol

Etik uttalande: Washington University Animal Studies Utskottet godkände alla mus infektioner och förfaranden som en del av protokoll nummer 20120216, som godkändes 2013/01/11 och löper 2016/01/11. Övergripande hand om djuren överensstämde med Guiden för vård och användning av försöksdjur från National Research Council och USDA Animal Care Resource Guide. Dödshjälp förfaranden är förenliga med "AVMA riktlinjer för avlivning av djur 2013 utgåva." 1. UPEC UTI protoko…

Representative Results

De intravesikala modeller av okomplicerad och kateter i samband UVI erbjuder flexibla plattformar för att belysa de molekylära mekanismerna av bakteriell patogenes, effekterna av dessa sjukdomar på värdvävnaden, samt utveckling och testning av nya metoder för att hantera dessa gemensamma och kostsamma infektioner. Beroende på musstam och patogen kan intravesikal ympning kan användas för att studera värd-patogen interaktioner att belysa faktorer som krävs för att initiera eller modulerande akut (Figur…

Discussion

Okomplicerad samhällsförvärvad UTI är en vanlig och kostsam infektion står för flera miljoner primärvårdsbesök varje år ^46. Dessutom Cautis är en vanlig vård förvärvad infektion som har blivit mycket kostsamt att vårdgivare som centran för Medicare och Medicaid Services inte längre ersätter leverantörer för den extra kostnaden för behandling till följd av vårdrelaterade CAUTI ^45. De musmodeller av UTI, både okomplicerad cystit och CAUTI, som beskrivs i dessa protokoll ger ov…

Materials

Material for catheter and needle preparation:
30ga needles	BD Precision Glide	305106	30Gx ½ (0.3 mm x 13mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 mL
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs – Stainless Steel – Large Capacity –
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 in
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 in x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1X Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299