Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

Eric Ehrke-Schulz; Wenli Zhang; Maren Schiwon; Thorsten Bergmann; Manish Solanki; Jing Liu; Philip Boehme; Theo Leitner; Anja Ehrhardt

doi:10.3791/52894

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Artigo de método

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

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DOI:

10.3791/52894

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28 de janeiro de 2016

Eric Ehrke-Schulz¹ , Wenli Zhang¹ , Maren Schiwon¹ , Thorsten Bergmann¹ , Manish Solanki¹ , Jing Liu¹ , Philip Boehme¹ , Theo Leitner¹ , Anja Ehrhardt¹

¹Institute of Virology and Microbiology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Department of Human Medicine, Faculty of Health, University Witten/Herdecke

Neste artigo

Resumo

Um protocolo para geração de vetores adenovirais de alta capacidade sem todas as sequências codificadoras virais é apresentado. A clonagem de transgenes contidos no genoma do vetor é baseada em endonucleases homing. A amplificação do vírus em células produtoras cultivadas como células aderentes e em suspensão depende de um vírus auxiliar que fornece genes virais em trans.

Resumo

Os vetores adenovirais de alta capacidade (HCAdV) desprovidos de todas as sequências codificadoras virais representam um dos vetores de entrega de genes mais avançados devido à sua alta capacidade de embalagem (até 35 kb), baixa imunogenicidade e baixa toxicidade. No entanto, para muitos laboratórios, o uso de HCAdV é dificultado pelo complicado procedimento de construção do genoma do vetor e produção de vírus. Aqui, um protocolo detalhado para clonagem e produção eficiente de HCAdV com base no plasmídeo pAdFTC contendo o genoma do HCAdV é descrito. A construção de genomas de HCAdV é baseada em um sistema de vetores de clonagem utilizando endonucleases homing (I-CeuI e PI-SceI). Qualquer gene de interesse de até 14 kb pode ser subclonado no vetor shuttle pHM5, que contém um sítio de clonagem múltipla flanqueado por I-CeuI e PI-SceI. Após a liberação mediada por I-CeuI e PI-SceI do transgene do vetor shuttle, o transgene pode ser inserido no vetor de clonagem HCAdV pAdFTC. Devido ao grande tamanho do plasmídeo pAdFTC e aos longos locais de reconhecimento das enzimas usadas associadas à forte ligação ao DNA, é necessário um manuseio cuidadoso dos fragmentos de clonagem. Para a produção do vírus, o genoma do HCAdV é liberado pela digestão NotI e transfectado em uma linha celular produtora baseada em HEK293 expressando de forma estável a Cre recombinase. Para fornecer todos os genes adenovirais para amplificação de adenovírus, é necessária a coinfecção com um vírus auxiliar contendo um sinal de empacotamento flanqueado por locais loxP. A pré-amplificação do vetor é realizada em células produtoras cultivadas em superfícies e a amplificação em larga escala do vetor é realizada em frascos giratórios com células produtoras cultivadas em suspensão. Para a purificação do vírus, são realizadas duas etapas de ultracentrifugação baseadas em gradientes de cloreto de césio, seguidas de diálise. Aqui são apresentadas dicas, truques e atalhos desenvolvidos nos últimos anos trabalhando com este sistema vetorial HCAdV.

Introdução

Para aplicações de terapia génica, é de grande importância para evitar efeitos colaterais citotóxicos e imunogénicas provocadas pela expressão de proteínas virais, a própria transgene ou por proteínas virais de entrada. Os vectores de adenovírus (Adv) são amplamente utilizados para introduzir ADN estranho numa ampla variedade de células para investigar o impacto da expressão do transgene ^1,2. A versão mais avançada do AdV é representado por adenovírus vetores de alta capacidade (HCAdV) que faltam todas as sequências codificadoras virais ^{3,4 e} oferecendo assim uma capacidade de acondicionamento até 35 kb, combinadas com baixa imunogenicidade e ba....