Påføre en induserbar Expression System for å studere forstyrrelser av bakteriell virulensfaktorer med intracellulære signal

Summary

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Abstract

Teknikken som presenteres her gjør det mulig å analysere ved hvilket trinn et målprotein, eller alternativt et lite molekyl, reagerer med komponentene i en signalveien. Metoden er basert, på den ene side, på den induserbare ekspresjonen av et spesifikt protein for å initiere en signaleringshendelse i en definert og forhåndsbestemt trinn i den valgte signalkaskade. Samtidig ekspresjon, på den annen side, av genet av interesse og deretter lar undersøkeren å vurdere om aktiviteten til det uttrykte proteinet målet befinner seg oppstrøms eller nedstrøms for den initierte signaleringshendelse, avhengig av avlesning av signalveien som er oppnådd. Her ble apoptotisk kaskade valgt som en definert signalveien for å demonstrere protokollen funksjonalitet. Patogene bakterier, for eksempel Coxiella burnetii, translocate effektor proteiner som forstyrrer verts celledød induksjon i vertscellen for å sikre overlevelse av bakterier i cellen, og for å fremme deresformidling i organismen. C. burnetii effektorproteinet CaeB hemmer effektivt verts celledød etter induksjon av apoptose med UV-lys eller med staurosporin. For å begrense hvor trinn CaeB interfererer med forplantningen av den apoptotiske signal, ble utvalgte proteiner med godt karakterisert pro-apoptotiske aktivitet uttrykt forbigående i en doksycyklin-induserbar måte. Hvis CaeB opptrer oppstrøms for disse proteiner, skal apoptose fortsette uhindret. Hvis CaeB fungerer nedstrøms, vil celledød bli hemmet. Test proteinene valgte var Bax, som virker på nivået av mitokondriene, og caspase 3, som er den store skarp protease. CaeB forstyrrer celledød indusert av Bax uttrykk, men ikke av caspase 3 uttrykk. CaeB således virker sammen med apoptotiske kaskade mellom disse to proteiner.

Introduction

Virulens av mange Gram-negative bakterielle patogener avhenger spesialiserte sekresjon systemer for å kapre eukaryote vertsceller. Bakterier bruke disse sekresjons-systemer for å injisere bakteriell virulens proteiner (Effektor) inn i vertscellen for å modulere en rekke biokjemiske og cellulære aktiviteter. Studiet av effektor proteiner har ikke bare gitt bemerkelsesverdig innsikt i grunnleggende aspekter av verts / patogen interaksjoner, men også inn i grunnleggende biologi av eukaryote celler ^1. Modulering av vertscellen apoptose er blitt vist å være en viktig mekanisme for virulens mange intracellulære patogener, og et antall effektor proteiner moduler apoptose er blitt identifisert ^2-9. Men deres nøyaktige molekylære mekanismer aktivitet forblir unnvikende i mange tilfeller.

Apoptose, en form for programmert celledød, spiller en viktig rolle i immunresponser mot infeksjoner ^10. To hovedveier som fører til apoptose hablitt identifisert: rettet mot mitokondrier (intrinsic apoptose) eller direkte transduksjon av signalet via celledød reseptorer på plasmamembranen (extrinsic apoptose). Den iboende eller mitokondrier-mediert celledød reaksjonsvei er utløst av intracellulære signaler og involverer aktivering av Bax og Bak, to pro-apoptotiske medlemmer av Bcl-2-familien. Denne familien består av pro- og anti-apoptotiske regulator proteiner som kontrollerer celledød ^11-14. Aktivering av apoptose fører til oligomerisering av Bax og Bak fulgt av etterfølgende permeabilization Mitokondriell ytre membran, noe som resulterer i cytokrom C slippes ut i cytoplasmaet. Cytokrom C frigivelse initierer aktivering av effektorcellene kaspasene 3 og 7 gjennom aktiveringen av caspase 9 i apoptosome ^15. Dette fører til proteolyse av utvalgte substrater som blant annet resulterer i eksponering av fosfatidylserin på celleoverflaten ¹⁶ og frigjør en dedikert DNase som fragmenter chromatin ^17,18.

For å bestemme hvor innenfor den apoptotiske kaskade et individ effektorproteinet griper ble en induserbar ekspresjon system som anvendes ^19. Regulatoriske systemer for betinget ekspresjon av transgener har vært et uvurderlig redskap for å analysere en proteinets funksjon i cellen eller dens betydning for vev, organ og organismen utvikling, så vel som under initiering, progresjon og opprettholdelse av sykdommer ^20-23. Typisk induserbare systemer, som for eksempel Tet systemet ²⁴ anvendt her, danner en kunstig transkripsjonsenhet (se figur 1). En komponent er en kunstig konstruerte transkripsjonsfaktor kalt TTA (tetracyklin-avhengig transkripsjon aktivator), dannet ved fusjon av bakterietranskripsjons tetR repressor ²⁵ til et pattedyr-protein domene som medierer transkripsjonen aktivering eller lyddemping ^24,26. Den andre komponenten er en hybridpromoter, betegnet TRE (tetracyklin-responsive element), som består av en eukaryot minimal promoter, inneholdende minst en TATA-boks og en transkripsjons-initieringssetet, sluttet til flere gjentakelser av beslektet DNA-bindingssetet for Tetr, Teto ^24,25. Den tredje komponenten er den naturlige ligand av tetR, tetracyklin eller et av dets derivater, slik som anhydrotetracycline eller doksycyklin ^25. Ved ligand tilsetning til kulturmediet, Tetr mister sin affinitet for teto og dissosierer fra TRE. Som et resultat, blir transkripsjon av målgenet avskaffet. Transgen ekspresjon kan således bli kontrollert på en tids- og doseavhengig måte i både cellekulturer og i dyr ^20,23,24. Med tta, oppstår transgen ekspresjon konstitutivt, bortsett fra i nærvær av et tetracyklin. Dette kan være en ulempe i studiet av cytotoksiske eller onkogene proteiner fordi tetracyklin først må fjernes fra systemet, før transgene expressioN inntreffer og målproteinet effekter på celle kan overvåkes. Dette kan være tidkrevende og ikke alltid er fullstendig, særlig i transgene dyr ^27. For å løse denne begrensningen, ble en mutant med tetra en invers reaksjon på tilstedeværelsen av doksycyklin som brukes til å generere en ny transkripsjonsfaktor, rtTA (omvendt TTA) ^28. Det binder seg bare til TRE og, samtidig, aktiverer transkripsjon i nærvær av doksycyklin. Residual leakiness av systemet, det vil si., Transgene ekspresjon i fravær av TRE-bundet transkripsjonsfaktor, som stammer enten (i) fra posisjon effekter på et genomisk integreringssete, (ii) fra TRE selv ^29, eller (iii) fra non -spesifikke binding av TTA / rtTA ^28, ble løst ved å innføre en ytterligere transkripsjonen lyddemper, betegnet TTS (tetracyklin-avhengige transkripsjons-lyddemperen) ³⁰ til systemet. Den danner en dobbel regulator nettverk sammen med rtTA (se figur 1).I fravær av doksycyklin, binder TTS til TRE og aktivt slår seg eventuelle gjenværende transkripsjon. I nærvær av doksycyklin, dissosierer TTS fra TRE og rtTA binder samtidig indusering av ekspresjon av målgenet. Dette ytterligere lag av stringens er ofte nødvendig for å uttrykke meget aktive cytotoksiske proteiner ^31-34.

Ved hjelp av denne kontrollert dobbelt-regulator system, kan den apoptotiske kaskade initieres ved en definert trinn som tillater analyse av hvorvidt den gitte effektorproteinet kan forstyrre apoptose-induksjon. Denne metoden kan ikke bare brukes til å undersøke anti-apoptotiske aktivitet av bakterie effektor proteiner, men også for den induserbare ekspresjon av pro-apoptotiske eller toksiske proteiner, eller for å dissekere interferens med andre signalveier.

Protocol

1. Produksjon av stabile cellelinjer som uttrykker proteinet av interesse Forbered media ved å legge varmeinaktivert FCS og 1% Penicillin / streptomycin til kommersielt tilgjengelige Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med Glutamax-I, pyruvat, og 4,5 g / l D-glukose. Dyrke HEK293 celler i media ved 37 ° C i 5% CO 2. Under dyrke celler hver tredje dag. Fjern media og resuspender cellene i 15 ml ferske medie. Pipette 1 ml inn i en ny 75 cm 2 cellekultur kolbe o…

Representative Results

Først ble det etablert HEK293-cellelinjer som stabilt uttrykker proteinet av interesse (CaeB) som et GFP-fusjonsprotein. Som en kontroll, ble HEK293-cellelinjer som stabilt uttrykker GFP også generert. Uttrykk for GFP og GFP-CaeB ble verifisert av immunoblotanalyse. Representanten immunoblot (Figur 4A) viser stabilt og klart påviselig uttrykk for GFP og GFP-CaeB. Imidlertid kan denne analysen ikke avgjøre om alle cellene uttrykker GFP eller GFP-CaeB. Derfor ble stabilt transfekterte HEK293-cellelinj…

Discussion

Mange patogene bakterier havn sekresjon systemer for å utskille eller translocate bakterielle effektor proteiner inn i vertscellen. Disse effektor proteiner har evnen til å modulere prosesser og veier i vertscellen, slik at bakterien å overleve og replikere innenfor deres respektive intracellulære nisje. Forstå biokjemiske aktiviteter og de molekylære mekanismer av effektor proteiner vil bidra til en bedre forståelse av sykdomsfremkallende og kan bidra til å utvikle nye terapeutiske verktøy for å bekjempe sykd…

Materials

DMEM	life technologies	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Pen/Strep	life technologies	15140-122
OptiMEM	life technologies	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Geneticin	Roth	CP11.3
Polyethylenimine	Polyscienes	23966
Doxycycline	Sigma Aldrich	D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad	170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Scientific	26616
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
anti-GFP	life technologies	A6455
anti-cleaved PARP	BD Bioscience	611038
anti-actin	Sigma Aldrich	A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-045
ECL Western Blotting Substrate	Thermo Scientific	32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	46428