Aplicando um sistema de expressão induzível para estudar interferência de fatores de virulência bacteriana com Sinalização Intracelular

Summary

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Abstract

A técnica aqui apresentada permite analisar em que o passo a proteína alvo, ou, alternativamente, uma molécula pequena, interage com os componentes de uma via de sinalização. O método baseia-se, por um lado, sobre a expressão indutível de uma proteína específica para iniciar um evento de sinalização a um passo definido e predeterminado na cascata de sinalização seleccionado. Expressão concomitante, por outro lado, do gene de interesse, em seguida, permite que o investigador para avaliar se a actividade da proteína alvo expressa está localizada a montante ou a jusante do evento de sinalização iniciada, de acordo com a leitura da via de sinalização que é obtido. Aqui, a cascata apoptótica foi seleccionado como uma via de sinalização definido para demonstrar a funcionalidade do protocolo. As bactérias patogénicas, tais como, Coxiella burnetii translocar proteínas efectoras que interferem com a indução da morte da célula hospedeira na célula hospedeira para assegurar a sobrevivência na célula bacteriana e para promover a suadisseminação no organismo. A C. proteína efectora burnetii CaeB inibe eficazmente a morte da célula hospedeira após indução da apoptose com luz UV ou com estaurosporina. Para diminuir no qual o passo CaeB interfere com a propagação do sinal apoptótico, as proteínas seleccionadas com actividade pro-apoptótica bem caracterizados foram expressos transitoriamente em forma doxiciclina-indutível. Se CaeB actua a montante destas proteínas, apoptose irá continuar sem obstáculos. Se CaeB actua a jusante, a morte celular é inibida. As proteínas de ensaio seleccionados foram Bax, que actua ao nível das mitocôndrias, e caspase 3, que é a principal protease verdugo. CaeB interfere com a morte celular induzida por expressão da Bax, mas não por caspase 3 expressão. CaeB, assim, interage com a cascata apoptótica entre estas duas proteínas.

Introduction

A virulência de muitos patógenos gram-negativas bactérias depende de sistemas de secreção especializados para seqüestrar células hospedeiras eucarióticas. As bactérias usam estes sistemas de secreção de proteínas para injectar de virulência da bactéria (efectoras) para dentro da célula hospedeira para modular uma variedade de actividades celulares e bioquímicas. O estudo das proteínas efetoras tem não só forneceu notável visão sobre aspectos fundamentais do host / agente patogénico, mas também para a biologia básica das células eucarióticas ^1. A modulação da apoptose da célula hospedeira tem sido demonstrado ser um importante mecanismo de virulência para muitos patogénios intracelulares, e uma série de proteínas efectoras que modulam a apoptose foram identificadas ^2-9. No entanto, os mecanismos moleculares precisos da actividade permanece indeterminada em muitos casos.

A apoptose, uma forma de morte celular programada, desempenha um papel importante nas respostas imunitárias à infecção ^{de 10.} Duas vias principais que conduzem à apoptose têmforam identificados: alvo as mitocôndrias (apoptose intrínseca) ou transdução directa do sinal via receptores de morte celular na membrana plasmática (apoptose extrínseca). A via intrínseca ou mediada por mitocôndrias morte celular é desencadeada por sinais intracelulares e envolve a activação do Bax e Bak, dois membros pró-apoptóticos da família Bcl-2. Esta família está composta por proteínas reguladoras pro- e anti-apoptóticas que controlam a morte celular ^11-14. A activação da apoptose conduz a oligomerização de Bax e Bak, seguido por subsequente permeabilização da membrana mitocondrial externa, resultando na libertação do citocromo C para o citoplasma. Liberação do citocromo C inicia a ativação das caspases efetoras 3 e 7 a ativação de caspase 9 no apoptossomo ^15. Isto leva à proteólise de substratos seleccionados que, entre outros, resulta na exposição de fosfatidilserina à superfície da célula ¹⁶ e liberta um ADNase dedicado que fragmenta chromatin ^17,18.

A fim de determinar onde dentro da cascata apoptótica uma proteína efectora indivíduo interfere, um sistema de expressão indutível foi empregado ^19. Os sistemas de regulação para a expressão dos transgenes condicionais têm sido uma ferramenta inestimável na análise de função de uma proteína dentro da célula ou a sua importância para o tecido, órgão e desenvolvimento organismo, bem como durante a iniciação, progressão e manutenção de doença ^20-23. Tipicamente, sistemas de controlo indutíveis, tais como o sistema Tet ²⁴ empregue aqui, formar uma unidade de transcrição artificial (ver Figura 1). Um componente é um factor de transcrição manipulado artificialmente chamado tTA (dependente da tetraciclina activador da transcrição), formado através da fusão do repressor de transcrição bacteriana TetR ²⁵ a um domínio de proteína de mamífero que medeia a activação da transcrição ou silenciamento ^24,26. O segundo componente é um híbridopromotor, denominada TRE (elemento de resposta a tetraciclina), que consiste de um promotor mínimo eucariótica, contendo, pelo menos, uma caixa TATÁ e um local de iniciação da transcrição, juntou-se a repetições múltiplas do local de ligação de ADN cognato para TetR, tetO ^24,25. O terceiro componente é o ligando natural de TetR, tetraciclina ou um dos seus derivados, tais como anidrotetraciclina ou doxiciclina ^25. Após a adição do ligando para o meio de cultura, TetR perde a sua afinidade para tetO e dissocia-se do TRE. Como resultado, a transcrição do gene alvo é abolida. A expressão de transgenes pode, assim, ser rigorosamente controladas de forma tempo e dependente da dose tanto na cultura de células e em animais ^20,23,24. Com tTA, a expressão do transgene ocorre constitutivamente, excepto na presença de uma tetraciclina. Isto pode ser uma desvantagem no estudo de proteínas citotóxicas ou oncogénicas porque tetraciclina primeiro tem de ser removido do sistema, antes do transgene expression ocorre e os efeitos da proteína alvo na célula pode ser monitorado. Isto pode ser demorado e nem sempre é completa, especialmente em animais transgénicos ^27. Para resolver esta limitação, um mutante TetR com uma resposta inversa à presença de doxiciclina foi utilizado para gerar um novo factor de transcrição, rtTA (reverso tTA) ^28. Só se liga ao TRE e, concomitantemente, activa a transcrição na presença de doxiciclina. Leakiness residual do sistema, isto é., A expressão do transgene, na ausência de factor de transcrição TRE-ligado, originando quer (i) a partir de efeitos de posição a um sítio de integração genómico, (ii) a partir do próprio TRE ^29, ou (iii) a partir non espec�ico ligação de tTA / rtTA ^28, foi abordado através da introdução de um silenciador da transcrição adicional, denominado TTS (dependente da tetraciclina silenciador da transcrição) ³⁰ para o sistema. Ele forma uma rede dupla juntamente com o regulador rtTA (ver Figura 1).Na ausência de doxiciclina, TTS se liga ao TRE e ativamente encerra qualquer transcrição restante. Na presença de doxiciclina, dissocia-se do TTS TRE e rtTA se liga simultaneamente induzir a expressão do gene alvo. Esta camada adicional de severidade é muitas vezes necessário para expressar proteínas citotóxicas altamente activas ^31-34.

Usando este sistema de duplo-regulador rigidamente controlado, a cascata apoptótica pode ser iniciado com um passo definido, que permita a análise de se o dada proteína efectora pode interferir com a indução de apoptose. Este método não só pode ser utilizado para estudar a actividade anti-apoptótica de proteínas efectoras bacterianas, mas também para a expressão induzível de proteínas pró-apoptóticas ou tóxicos, ou para dissecar a interferência com outras vias de sinalização.

Protocol

1. Produção de linhas celulares estáveis ​​expressando a proteína de interesse Prepare meios por adição de FCS inactivado por calor e 1% de Penicilina / Estreptomicina a comercialmente disponível Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com GlutaMAX-I, piruvato, e 4,5 g / L de D-Glucose. Cultivar células HEK293 em meio a 37 ° C em 5% de CO 2. Sub-cultivar células a cada três dias. Remova a mídia e ressuspender as células em 15 ml de meio recente. Pipeta de 1 ml…

Representative Results

Primeiro, foram estabelecidas linhas de células HEK293 que expressam de forma estável a proteína de interesse (CaeB) como uma proteína de fusão GFP-. Como um controlo, as linhas celulares HEK293 que expressam estavelmente GFP também foram gerados. Expressão de GFP e GFP-CaeB foi verificada por análise de imunotransf erência. A imunotransferência representativo (Figura 4A) demonstra a expressão estável e facilmente detectável de GFP e GFP-CaeB. No entanto, este ensaio não pode determinar se…

Discussion

Muitas bactérias patogénicas abrigar sistemas de secreção para segregar proteínas efectoras ou translocar bacterianas na célula hospedeira. Estas proteínas efectoras têm a capacidade de modular processos e vias na célula hospedeira, permitindo que as bactérias para sobreviver e replicar no respectivo nicho intracelular. Entender as atividades bioquímicas e os mecanismos moleculares das proteínas efetoras contribuirá para um melhor entendimento da patogenia e podem ajudar a desenvolver novas ferramentas tera…

Materials

DMEM	life technologies	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Pen/Strep	life technologies	15140-122
OptiMEM	life technologies	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Geneticin	Roth	CP11.3
Polyethylenimine	Polyscienes	23966
Doxycycline	Sigma Aldrich	D9891
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8000EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad	170-3940
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Scientific	26616
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010
anti-GFP	life technologies	A6455
anti-cleaved PARP	BD Bioscience	611038
anti-actin	Sigma Aldrich	A2066
Mouse IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-062
Rabbit IgG (H+L)-HRPO	Dianova	111-035-045
ECL Western Blotting Substrate	Thermo Scientific	32106
Restore Plus Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientific	46428