En metod för att tillfoga Stängd Head traumatisk hjärnskada i<em> Drosophila</em

Summary

Här beskriver vi en metod för att tillfoga sluten huvudtraumatisk hjärnskada (TBI) i Drosophila. Denna metod utgör en knytpunkt för att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som ligger bakom TBI sjukdomar med hjälp av den stora förekomsten av experimentella verktyg och tekniker som flugor.

Abstract

Traumatisk hjärnskada (TBI) drabbar miljontals människor varje år, vilket orsakar försämring av fysiska, kognitiva och beteendemässiga funktioner och död. Studier med Drosophila har bidragit viktiga genombrott i förståelsen neurologiska processer. Således, med målet att förstå den cellulära och molekylära grunden för TBI patologier hos människor, har vi utvecklat High Impact Trauma (HIT) enhet för att tillfoga stängda huvudet TBI i flugor. Flugor utsattes för HIT enhetens display fenotyper är förenliga med mänskliga TBI såsom tillfällig arbetsoförmåga och progressiv neurodegeneration. HIT enheten använder en fjäderbaserad mekanism för att driva flugor mot väggen av ett kärl, vilket orsakar mekaniska skador på flugan hjärnan. Anordningen är billig och enkel att konstruera, dess drift är enkelt och snabbt, och det ger reproducerbara resultat. Följaktligen kan HIT anordningen kombineras med befintliga experimentella verktyg och tekniker för flugor för att hantera grundläggandefrågor om TBI som kan leda till utveckling av diagnostik och behandling för TBI. I synnerhet kan den HIT anordningen användas för att utföra storskaliga genetiska skärmar för att förstå den genetiska grunden för TBI patologier.

Introduction

Traumatisk hjärnskada (TBI) definieras som skada i hjärnan från en extern mekanisk kraft. Vanligast TBI resultat från sluten huvudkrafter såsom trubbiga krafter och tröghetsacceleration och retardationskrafter som orsakar hjärnan att träffa insidan av skallen. I USA är det uppskattas att 50.000 personer dör varje år från TBI och 2,5-6.500.000 personer lever med konsekvenserna av TBI, inklusive försvagande fysiska, kognitiva och beteendeproblem ^1,2. Konsekvenserna av TBI är inte bara på grund av primära mekaniska skador på hjärnan utan även för sekundära cellulära och molekylära skador på hjärnan liksom andra vävnader som sker över tiden ^3-5. Utvecklingen av metoder för att diagnostisera och behandla TBI har visat sig vara svårt eftersom TBI är en komplex sjukdomsprocess. Den rörliga karaktär av primära skador, människans fysiologi och miljöfaktorer resulterar i heterogena sekundära injuries och patologier. Underliggande variabla faktorer inkluderar allvarligheten av den primära skadan, tiden mellan upprepade primära skador, och åldern och genotyp hos individen. Att förstå hur varje variabel faktor bidrar till konsekvenserna av TBI är sannolikt att underlätta utvecklingen av metoder för att diagnostisera och behandla TBI ^6,7.

Här beskriver vi en metod för att tillfoga sluten huvud TBI i Drosophila melanogaster (fruktflugor) som kan användas för att beskriva bidrag variabla faktorer till konsekvenserna av TBI. Metoden bygger på en inledande iakttagelse som intensivt träffa sidan av en fluga kulturflaska mot en handflata orsakade vildtyp flugor för att bli tillfälligt arbetsoförmögen, en sannolik konsekvens av TBI. Därför byggde vi High-Impact Trauma (HIT) anordning för att sammanfatta de accelerations- och retardationskrafter från hand slå åtgärder. En höghastighetsfilm visar att en enda strejk frånHIT enheten orsakar flyger till kontakta flaskan väggen flera gånger med huvudet och kroppen ^8. Till viss del, alla kontakter kan orsaka flugan hjärnan att rikoschett och deformeras mot huvudet kapsel, som liknar vad som händer med människor i fall och bilolyckor ^9. Följaktligen flugor behandlades med HIT enhetens display fenotyper är förenliga med hjärnskada, inklusive tillfällig arbetsoförmåga följd av ataxi, gradvis återhämtning av rörlighet, genuttryck förändringar i huvudet, och progressiv neurodegeneration i hjärnan ^10. Således gör HIT anordningen det möjligt att studera TBI hjälp av enorma arsenal av experimentella verktyg och tekniker som utvecklats för flugor.

Protocol

1. Konstruktion av HIT Device Fäst fjädern till styrelsen med två klämmor och fyra skruvar (Figur 1A). Centrera klämmorna i förhållande till bredden av styrelsen och rumpan upp dem mot varandra med den yttre klämjämnhöjd med kanten av styrelsen. Innan fastsättning av klämmor, böja dem med en tång för att passa tätt över våren. OBS: Se tabell 1 för en beskrivning av det material som krävs för att konstruera HIT enheten. Den fastklämda slutet av vå…

Representative Results

Vi är intresserade av att förstå varför flugor dör strax efter primär skada. För att kvantifiera död, bestämde vi Mortality index vid 24 h (MI 24), vilket är den procentuella andelen av flugor som dog inom 24 timmar av den primära skadan. Flugor som utsätts för slag från HIT anordningen inkuberades vid 25 ° C i en injektionsflaska med fly mat, och antalet döda flugor räknades efter 24 timmar. Vi använde denna metod för att identifiera faktorer som påverkar MI 24 och fann att MI …

Discussion

HIT anordningen metoden skiljer sig från andra metoder som vållar traumatisk skada i flugor av det faktum att det orsakar sluten huvud snarare än penetrerande TBI ^11. Dessutom tar HIT enhet metoden mindre tid, ansträngning och skicklighet för att orsaka TBI i många flugor, så metoden är mer mottaglig än andra metoder för storskaliga genetiska skärmar. Slutligen, det faktum att primära skador orsakade av HIT anordningen inte är begränsade till hjärnan är både en begränsning och en fördel. De…

Materials

Zinc plated compression spring	The Hillman  Group	540189	9 7/8 in (length), 15/16 in (outer diameter), 0.12 in (wire size)
Wooden board			9 in (length), 6.5 in (width), 0.75 in (height)
Clamps	Sigma Electrical Manufacturing Corporation	49822	3.10 in (length), 0.68 in (width), 1.11 in (height), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch steel EMT conduit
Loop half of self-adhesive velcro			3 in (length), (3/4 in width)
Polyurethane ice bucket cover	Fisher Scientific	02-591-45	9 1/8 in (length), 9 1/8 in (width), 1 1/4 in (height)
Plastic fly vials	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 in (height), 1 1/16 in (inner diameter), 1 1/8 in (outer diameter)
Large cotton balls	Fisher Scientific	22-456-883
Paper protractor			10 in (diameter)