We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.
When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.
Gzms היא משפחה של פרוטאזות סרין ההומולוגית מאוד מקומי בlysosomes מיוחד של CTL ותאי NK 1. הגרגרים הרעילים לתאים של תאי רוצח אלה מכילים גם חלבוני שיבוש-קרום PFN וGNLY שפורסמו בו זמנית עם Gzms על הכרת תא מטרה המיועד לחיסול 2,3. ישנם חמש Gzms בבני אדם (GzmA, B, H, K ו- M), ו -10 Gzms בעכברים (GzmA – G, K, M ו- N). GzmA וGzmB הם נפוצים ביותר ונחקר בהרחבה בבני אדם ועכברים 1. עם זאת, מחקרים שנעשה לאחרונה יותר החלו לחקור את מסלולי תא-מוות, כמו גם את ההשפעות ביולוגיות נוספות בתיווך Gzms האחר, שנקרא היתום בבריאות ובחוליים 4.
הפונקציה הידועה ביותר של Gzms, בפרט של GzmA וGzmB, היא האינדוקציה של מות תאים מתוכנת בתאי יונקים, כאשר נמסרו לתאי המטרה על ידי PFN 5,6. עם זאת, יותר מחקרים שנעשה לאחרונה הראו גם השפעות תאית של Gzms עם השפעה עמוקה על רגולציה ודלקת חיסוניות, באופן בלתי תלויים על ידי משלוח cytosolic PFN 7,8. הספקטרום של תאים שנהרגו ביעילות לאחר כניסת cytosolic של Gzms גם התרחב לאחרונה מתאי יונקים לחיידקי 9,10 ואפילו טפילים מסוימים 11. הגילויים האחרונים אלה נפתחו שדה חדש לגמרי לחוקרי Gzm. לכן,, מערכת יונקים ביטוי תשואה גבוהה יעילה וחסכונית באופן משמעותי להקל את הדרך למחקרים עתידיים אלה.
Gzms האנושי, עכבר והחולדה ילידים כבר מטוהר בהצלחה מחלק גרגיר של קווי תאי CTL וNK 12-14. עם זאת, בידיים שלנו התשואה של טכניקות טיהור כזה היא בטווח של תרבות פחות מ -0.1 מ"ג / L תא (תצפית לא פורסם ו -12). יתר על כן, החלטת chromatographic של Gzm יחיד ללא זיהום על ידי טיהורGzms ו / או חלבונים שנמצאים גם בגרגרים r מאתגר (נתונים שלא פורסם ו12,14). Gzms רקומביננטי הופק בחיידקי 15, שמרי 16, תאי חרקים 17 ובאפילו בתאי יונקים כגון 293 HEK 18,19. רק מערכות ביטוי היונקים לשאת הפוטנציאל לייצר אנזימי רקומביננטי עם שינויי posttranslational זהים לחלבון הרעיל לתאים המקומי. שינויי Posttranslational היו מעורבים עם הספיגה הספציפית על ידי אנדוציטוזה והלוקליזציה תאית של פרוטאז בתוך תאי יעד 20-22. לכן, על ידי השימוש בpHLsec 23 (מתנת סוג של ראדו Aricescu והאיבון ג'ונס, אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה) כעמוד שדרת פלסמיד ביטוי Gzm, הקמנו מערכת פשוטה, זמן ועלות-יעילה לייצור חלבון תשואה גבוהה ב תאי HEK293T. pHLsec משלב משפר CMV עם אמרגן Β אקטין עוף; יחד, מרכיבים אלה demonstraטד פעילות האמרגן החזק ביותר בשורות תאים שונות 24. בנוסף, מכיל פלסמיד אינטרון ארנב Β-גלובין, אותות קוזאק והפרשה מותאמים, ליס-6xHis-תג ופולי-אות. ניתן לשכפל מוסיף נוחות בין אות ההפרשה ויס-6xHis התג (איור 1) להבטיח ביטוי אופטימלי ויעילות הפרשה לחלבונים חסרי תחומים N-מסוף מתאימים. לביטוי של Gzms, החלפנו את רצף אות הפרשת אנדוגני עם אות ההפרשה הניתנת על ידי הווקטור אחרי enterokinase אתר (EK) (DDDDK), כך שטיפול EK הופעל Gzms המופרש (Gzms הפעיל להתחיל עם N-המסוף רצף חומצות אמינו IIGG 25). בנוסף לטובת לשיטה זו, תאי HEK293T לצמוח במהירות בינוני במחיר נמוך, כגון בינוני של הנשר (DMEM) השתנה Dulbecco, ומתאימים גם לשיטת transfection סידן-פוספט עלות-יעילה.
התפקיד הקלאסי ונחקר בהרחבה של GzmA וGzmB הוא האינדוקציה של אפופטוזיס בתאי יונקים לאחר לידת cytosolic על ידי חלבון יוצרים הנקבובית 1 PFN. לאחרונה, הספקטרום ציטוטוקסיות של Gzms הורחב באופן משמעותי מתאי יונקים לחיידקים 9,10, כמו גם לטפילים מסוימים 11. יתר על כן, הפונק?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Novartis Foundation for Medical-Biological Research and from the Research Pool of the University of Fribourg (to MW). We thank Li Zhao, Zhan Xu, and Solange Kharoubi Hess for technical support, as well as Radu Aricescu and Yvonne Jones (Oxford University, UK) for providing the pHLsec plasmid, and Thomas Schürpf (Harvard Medical School) for helpful discussions.
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
HisTrap Excel 5ml-column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
HiTrap SP HP 5 ml-column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |