תשואה גבוהה ומערכת ביטוי עלות-יעילה של Granzymes האדם בתאי יונקים
Summary
We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.
Abstract
When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.
Introduction
Gzms היא משפחה של פרוטאזות סרין ההומולוגית מאוד מקומי בlysosomes מיוחד של CTL ותאי NK 1. הגרגרים הרעילים לתאים של תאי רוצח אלה מכילים גם חלבוני שיבוש-קרום PFN וGNLY שפורסמו בו זמנית עם Gzms על הכרת תא מטרה המיועד לחיסול 2,3. ישנם חמש Gzms בבני אדם (GzmA, B, H, K ו- M), ו -10 Gzms בעכברים (GzmA – G, K, M ו- N). GzmA וGzmB הם נפוצים ביותר ונחקר בהרחבה בבני אדם ועכברים 1. עם זאת, מחקרים שנעשה לאחרונה יותר החלו לחקור את מסלולי תא-מוות, כמו גם את ההשפעות ביולוגיות נוספות בתיווך Gzms האחר, שנקרא היתום בבריאות ובחוליים 4.
הפונקציה הידועה ביותר של Gzms, בפרט של GzmA וGzmB, היא האינדוקציה של מות תאים מתוכנת בתאי יונקים, כאשר נמסרו לתאי המטרה על ידי PFN 5,6. עם זאת, יותר מחקרים שנעשה לאחרונה הראו גם השפעות תאית של Gzms עם השפעה עמוקה על רגולציה ודלקת חיסוניות, באופן בלתי תלויים על ידי משלוח cytosolic PFN 7,8. הספקטרום של תאים שנהרגו ביעילות לאחר כניסת cytosolic של Gzms גם התרחב לאחרונה מתאי יונקים לחיידקי 9,10 ואפילו טפילים מסוימים 11. הגילויים האחרונים אלה נפתחו שדה חדש לגמרי לחוקרי Gzm. לכן,, מערכת יונקים ביטוי תשואה גבוהה יעילה וחסכונית באופן משמעותי להקל את הדרך למחקרים עתידיים אלה.
Gzms האנושי, עכבר והחולדה ילידים כבר מטוהר בהצלחה מחלק גרגיר של קווי תאי CTL וNK 12-14. עם זאת, בידיים שלנו התשואה של טכניקות טיהור כזה היא בטווח של תרבות פחות מ -0.1 מ"ג / L תא (תצפית לא פורסם ו -12). יתר על כן, החלטת chromatographic של Gzm יחיד ללא זיהום על ידי טיהורGzms ו / או חלבונים שנמצאים גם בגרגרים r מאתגר (נתונים שלא פורסם ו12,14). Gzms רקומביננטי הופק בחיידקי 15, שמרי 16, תאי חרקים 17 ובאפילו בתאי יונקים כגון 293 HEK 18,19. רק מערכות ביטוי היונקים לשאת הפוטנציאל לייצר אנזימי רקומביננטי עם שינויי posttranslational זהים לחלבון הרעיל לתאים המקומי. שינויי Posttranslational היו מעורבים עם הספיגה הספציפית על ידי אנדוציטוזה והלוקליזציה תאית של פרוטאז בתוך תאי יעד 20-22. לכן, על ידי השימוש בpHLsec 23 (מתנת סוג של ראדו Aricescu והאיבון ג'ונס, אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה) כעמוד שדרת פלסמיד ביטוי Gzm, הקמנו מערכת פשוטה, זמן ועלות-יעילה לייצור חלבון תשואה גבוהה ב תאי HEK293T. pHLsec משלב משפר CMV עם אמרגן Β אקטין עוף; יחד, מרכיבים אלה demonstraטד פעילות האמרגן החזק ביותר בשורות תאים שונות 24. בנוסף, מכיל פלסמיד אינטרון ארנב Β-גלובין, אותות קוזאק והפרשה מותאמים, ליס-6xHis-תג ופולי-אות. ניתן לשכפל מוסיף נוחות בין אות ההפרשה ויס-6xHis התג (איור 1) להבטיח ביטוי אופטימלי ויעילות הפרשה לחלבונים חסרי תחומים N-מסוף מתאימים. לביטוי של Gzms, החלפנו את רצף אות הפרשת אנדוגני עם אות ההפרשה הניתנת על ידי הווקטור אחרי enterokinase אתר (EK) (DDDDK), כך שטיפול EK הופעל Gzms המופרש (Gzms הפעיל להתחיל עם N-המסוף רצף חומצות אמינו IIGG 25). בנוסף לטובת לשיטה זו, תאי HEK293T לצמוח במהירות בינוני במחיר נמוך, כגון בינוני של הנשר (DMEM) השתנה Dulbecco, ומתאימים גם לשיטת transfection סידן-פוספט עלות-יעילה.
Protocol
Representative Results
Discussion
התפקיד הקלאסי ונחקר בהרחבה של GzmA וGzmB הוא האינדוקציה של אפופטוזיס בתאי יונקים לאחר לידת cytosolic על ידי חלבון יוצרים הנקבובית 1 PFN. לאחרונה, הספקטרום ציטוטוקסיות של Gzms הורחב באופן משמעותי מתאי יונקים לחיידקים 9,10, כמו גם לטפילים מסוימים 11. יתר על כן, הפונק?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Novartis Foundation for Medical-Biological Research and from the Research Pool of the University of Fribourg (to MW). We thank Li Zhao, Zhan Xu, and Solange Kharoubi Hess for technical support, as well as Radu Aricescu and Yvonne Jones (Oxford University, UK) for providing the pHLsec plasmid, and Thomas Schürpf (Harvard Medical School) for helpful discussions.
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5ml-column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml-column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
Referências
- Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
- Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
- Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
- Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
- Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).
- Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
- Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
- Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
- Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
- Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
- Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
- Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
- Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
- Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
- Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
- Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
- Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
- Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
- Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
- Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
- Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. . Nature. 377, 446-448 (1995).
- Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
- Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
- Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
- Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
- Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
- Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).
- Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3′ processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
- Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
- Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).
