포유 동물 세포에서 인간의 Granzymes의 높은 수율과 비용 효율적인 발현 시스템
Summary
We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.
Abstract
When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.
Introduction
Gzms 전문 CTL의 리소좀과 NK 세포 1 지역화 높은 상동 세린 프로테아제의 가족입니다. 이러한 킬러 세포의 세포 독성 과립은 제거 2,3 향하는 표적 세포의 인식에 Gzms와 동시에 출시되는 막 방해 단백질 PFN 및 GNLY가 포함되어 있습니다. (- G, K, M과 N GzmA) 인간 (GzmA, B, H, K와 M)에서 다섯 Gzms 및 마우스에서 10 Gzms이 있습니다. GzmA과 GzmB이 가장 풍부하고 광범위하게 인간과 생쥐 한 연구이다. 그러나, 최근의 연구들은 세포 사멸 경로뿐만 아니라 건강과 질환 4 다른, 소위 고아 Gzms에 의해 매개되는 생물학적 효과를 추가로 조사하기 시작했다.
5,6- PFN에 의해 표적 세포 내로 전달 된 경우 Gzms의 가장 잘 알려진 함수와 GzmA GzmB의 특히 포유 동물 세포에서 프로그래밍 된 세포 사멸을 유도한다. 그러나더 최근의 연구는 또한 PFN 7,8 독립적으로 세포질 전달, 면역 조절 및 염증에 깊은 영향을 Gzms의 세포 외 효과를 보여 주었다. Gzms의 세포질 기입 한 후 효율적으로 살해 세포의 스펙트럼은 최근 박테리아 9, 10, 심지어 특정 기생충 (11) 포유 동물 세포에서 확대되었다. 이러한 최근의 발견은 GZM 연구원에 대한 완전히 새로운 분야를 열었다. 따라서, 비용 효율적인, 고 수율 포유 동물 발현 시스템은 크게 그 미래 연구에 대한 방법을 완화합니다.
네이티브 인간, 마우스 및 래트 Gzms 성공적 CTL 및 NK 세포 라인 12-14의 과립 분획으로부터 정제 하였다. 그러나, 우리의 손에 이러한 정제 기술의 수율은 0.1 ㎎ / ℓ, 세포 배양 (미공개 관측 및 12)의 범위이다. 또한, 인접하여 오염이없는 단일의 GZM 크로마토 해상도R Gzms 및 / 또는 과립 형태로도 존재하는 단백질 (게시되지 않은 데이터와 12, 14)에 도전하고있다. 재조합 Gzms 심지어 이러한 HEK 293 18,19 같은 포유 동물 세포에서 세균 15, 16, 효모, 곤충 세포 및 17에서 제조 하였다. 만 포유류 발현 시스템은 원시 세포 독성 단백질과 동일한 번역 후 변형으로 재조합 효소를 생산할 수있는 가능성을 부담. 번역 후 변형은 엔도 사이토 시스에 의해 특정 흡수 및 표적 세포 20-22 내의 단백질 분해 효소의 세포 내 현지화에 연루되어있다. 따라서, pHLsec (23)를 사용하여 GZM 발현 플라스미드 백본 (라두 Aricescu과 이본 존스, 옥스포드, 영국의 대학의 일종 선물), 우리는 높은 수율 단백질 생산을위한 간단하고, 시간과 비용 효율적인 시스템을 구축 HEK293T 세포. pHLsec는 닭 Β-액틴 프로모터와 CMV 증강을 결합; 함께, 이러한 요소는 demonstra테드 다양한 세포 라인 (24)에서 가장 강력한 프로모터 활성. 또한, 플라스미드는 토끼 Β-글로빈 인트론, 최적화 된 코작과 분비 신호리스 – 6xHis 태그 및 폴리 신호가 포함되어 있습니다. 삽입이 분비 신호와 적절한 N- 말단 도메인을 부족한 단백질에 대한 최적의 발현과 분비 효율을 보장리스 – 6xHis 태그 (그림 1) 사이에 편리하게 복제 할 수 있습니다. Gzms의 발현을 위해, 우리는되도록 EK 치료 분비 Gzms는 (활성 Gzms는 N – 말단으로 시작 활성화 된 엔테로 키나제 (EK) 사이트 (DDDDK) 뒤에 벡터에 의해 제공 분비 신호 내인성 분비 신호 서열로 대체 아미노산 서열 IIGG 25). 또한이 방법에 대한 찬성, HEK293T 세포는 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM)로, 저가의 매체에 빠른 속도로 성장하고, 비용 효율적인 칼슘 포스페이트 형질 전환 방법에 적합하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
GzmA 및 GzmB의 고전과 광범위하게 연구 역할은 기공 형성 단백질 PFN 1로 그들의 세포질 배달 후 포유 동물 세포에서 세포 사멸의 유도이다. 최근 Gzms의 세포 독성 스펙트럼 세균 9,10뿐만 아니라 특정 기생충 (11)에 포유류 세포에서 현저하게 확대시켰다. 또한, GzmA 및 GzmB의 비 고전적, 세포 외 기능뿐만 아니라 다양한 고아 Gzms의 생물학적 중요성은 여전히 불분명하다. 이 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Novartis Foundation for Medical-Biological Research and from the Research Pool of the University of Fribourg (to MW). We thank Li Zhao, Zhan Xu, and Solange Kharoubi Hess for technical support, as well as Radu Aricescu and Yvonne Jones (Oxford University, UK) for providing the pHLsec plasmid, and Thomas Schürpf (Harvard Medical School) for helpful discussions.
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5ml-column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml-column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
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