Высокодоходные и экономически эффективной системы Выражение человека Гранзимы в клетках млекопитающих
Summary
We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.
Abstract
When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.
Introduction
В Gzms являются линейку гомологичных серинпротеаз локализованных в специализированных лизосомах CTL и NK клеток 1. Цитотоксические гранулы этих клеток-киллеров также содержат мембранные белки, разрушающие PFN и GNLY, которые выделяются одновременно с Gzms при обнаружении клетке-мишени, предназначенного для устранения 2,3. Есть пять Gzms в организме человека (GzmA, B, H, K и М) и 10 Gzms у мышей (GzmA – G, K, M и N). GzmA и GzmB являются наиболее распространенным и широко изучается в людях и мышах 1. Однако более поздние исследования начали исследовать клетки-смерти путей, а также дополнительные биологические эффекты, опосредованные другими, так называемыми сирот Gzms в здоровье и болезни 4.
Самый известный функция Gzms, в частности GzmA и GzmB, является индукция запрограммированной клеточной гибели в клетках млекопитающих при доставке в клетки-мишени с PFN 5,6. Однако, Более поздние исследования также показали, внеклеточные эффекты Gzms с глубоким воздействием на иммунную регулирования и воспаления, независимо от цитозольной доставки по PFN 7,8. Спектр клеток, которые убивают эффективно после вступления в цитозоле из Gzms был недавно расширен из клеток млекопитающих к бактериям 9,10 и даже некоторых паразитов 11. Эти недавние открытия открыли совершенно новую область для GZM исследователей. Таким образом, экономически эффективной, высокой текучести система экспрессии млекопитающих значительно облегчить путь для тех будущих исследований.
Родные человека, мыши и крысы Gzms успешно очищают от фракции гранул из CTL и NK клеток линий 12-14. Тем не менее, в наших руках выход из таких приемов очистки находится в диапазоне от менее чем 0,1 мг / л клеточной культуры (неопубликованной наблюдения и 12). Кроме того, хроматографический разрешение одной GZM без загрязнения флористикуR Gzms и / или белки, которые также присутствуют в гранулах является сложной задачей (неопубликованные данные и 12,14). Рекомбинантные Gzms были произведены в 15 бактерий, дрожжей, 16 клеток насекомых 17 и в даже в клетках млекопитающих, таких как НЕК 293 18,19. Только млекопитающих системы экспрессии несут потенциал для производства рекомбинантных ферментов с пост-трансляционных модификаций, идентичных родной цитотоксического белка. Посттрансляционных модификаций были вовлечены с конкретным поглощением эндоцитоза и внутриклеточной локализации протеазы в клетках-мишенях 20-22. Таким образом, с помощью pHLsec 23 (вид подарок Раду Aricescu и Ивонн Джонс Оксфордского университета, Великобритания) в качестве плазмиды для экспрессии позвоночника GZM, мы создали простую, времени и экономичное систему производства белка с высоким выходом в HEK293T клетки. pHLsec сочетает в себе ЦМВ усилитель с куриным Β-актина; Все вместе эти элементы ДЕМОНСТРАТед сильный промотор деятельность в различных клеточных линиях 24. Кроме того, плазмида содержит кролика Β-глобина интрон, оптимизированные Козак и сигналы секреции, а Lys-6xHis-тег и поли-сигнала. Вставки могут быть клонированы удобно между сигналом секреции и Lys-6xHis-тега (рис 1) обеспечение оптимальной экспрессии и секреции эффективности для белков, лишенных соответствующие N-концевые домены. Для экспрессии Gzms, мы заменили эндогенного последовательность секреции сигнала с сигналом секреции, предоставленной вектора с последующим энтерокиназа (ЕК) на сайте (DDDDK), так что лечение ЕК активировала выделяемые Gzms (активные Gzms начать с N-терминал аминокислотная последовательность IIGG 25). Кроме того, в пользу для этого метода HEK293T клетки быстро растут в цене низкой среде, такой как модифицированной Игла среде Игла (DMEM), и хорошо подходит для экономичного кальция фосфата методом трансфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Классической и широко изучается роль GzmA и GzmB является индукция апоптоза в клетках млекопитающих после их доставки по цитозольном порообразующего белка PFN 1. Недавно цитотоксический спектр Gzms была существенно расширена из клеток млекопитающих к бактериям 9,10, а также в некот…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Novartis Foundation for Medical-Biological Research and from the Research Pool of the University of Fribourg (to MW). We thank Li Zhao, Zhan Xu, and Solange Kharoubi Hess for technical support, as well as Radu Aricescu and Yvonne Jones (Oxford University, UK) for providing the pHLsec plasmid, and Thomas Schürpf (Harvard Medical School) for helpful discussions.
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA isolation kit |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells | Sigma | 14571C | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Enterokinase from bovine intestine | Sigma | E4906 | recombinant, ≥20 units/mg protein |
| HisTrap Excel 5ml-column | GE Healthcare | 17-3712-06 | Nickel IMAC |
| HiTrap SP HP 5 ml-column | GE Healthcare | 17-1152-01 | S column |
| N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT) | Sigma | C3647 | GzmA substrate |
| Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) | MP Biomedicals | 2193608 _10mg | GzmB substrate |
| Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL) | Bachem | GzmM substrate | |
| 5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) | Sigma | D8130 | Ellman`s reagent |
Referências
- Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
- Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
- Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
- Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
- Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
- Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).
- Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
- Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
- Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
- Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
- Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
- Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
- Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
- Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
- Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
- Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
- Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
- Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
- Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
- Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
- Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
- Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
- Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
- Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. . Nature. 377, 446-448 (1995).
- Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
- Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
- Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
- Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
- Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
- Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
- Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419 (2014).
- Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3′ processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
- Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
- Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).
