Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.
एक सेल फैटी का चित्रण अपने कार्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। यह एक ऐसी आंतों उपकला के enteroendocrine कोशिकाओं के रूप में विविध प्रकार की कोशिकाओं से बना ऊतकों भर में दूर तक फैला हुआ दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं के लिए एक मुश्किल परियोजना हो सकती है। 1,000: वे 1 के अनुपात में अन्य उपकला कोशिकाओं के बीच बिखरे हैं क्योंकि खाद्य और बैक्टीरिया के इन जठरांत्र सेंसर अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो गया है। हाल ही में, ट्रांसजेनिक संवाददाता चूहों प्रतिदीप्ति के माध्यम से enteroendocrine कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उत्पन्न किया गया है। उन में से एक पेप्टाइड YY-GFP माउस है। इस माउस का प्रयोग, हम confocal और धारावाहिक ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सहसंबंधी करने के लिए एक विधि विकसित की है। हम विधि cocem3D का नाम है और ऊतकों में एक विशिष्ट enteroendocrine सेल की पहचान करने और 3 डी में सेल के फैटी अनावरण करने के लिए आवेदन किया। cocem3D का संकल्प मात्रा पुनः के लिए कोशिका झिल्ली स्रावी vesicles के रूप में के रूप में छोटे अंगों की पहचान करने के लिए और अलग करने के लिए पर्याप्त हैndering। Cocem3D आसानी से अपने देशी ऊतकों में अन्य विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के 3 डी फैटी अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
एक कोशिका के अंदर जीवन समय और अंतरिक्ष में जगह लेता है। समय के साथ परिवर्तन अक्सर सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तरह प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक के साथ संयुक्त समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग अध्ययन कर रहे हैं। अंतरिक्ष, एक सेल या सेल करने वाली सेल बातचीत के अंदर अंगों की व्यवस्था विशेष रूप से, केवल सेल के ठीक संरचना की एक पूरी खाते से प्राप्त किया जा सकता है। एक सेल के ठीक संरचना की एक व्यापक खाते भी सी की तरह, जीनोम उपलब्ध है जिन मामलों में जीनोमिक कार्य करने के लिए स्पष्टता ला सकता है एलिगेंस निमेटोड 1 या फ्लैट प्लेकोजोआ tricoplax 2 adherens। सीरियल सेक्शनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अब एक कुशल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, समय, और धारावाहिक ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3 (SBEM) जैसे स्वचालित 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों के विकास के लिए कम खर्चीला काम धन्यवाद है।
समारोह को स्पष्ट करने के लिए संरचनात्मक जानकारी के लिए आवश्यकता के कुछ सेल में बहुत स्पष्ट हैइस तरह के न्यूरॉन्स, glia, या संवेदी उपकला कोशिकाओं के रूप में समारोह भौतिक सेल करने वाली सेल बातचीत पर निर्भर करता है, जहां एल प्रकार,। हम पेट के लुमेन में पोषक तत्वों से संवेदी संकेतों अंततः भूख बढ़ाने वाला व्यवहार modulates कि एक विद्युत संकेत में transduced रहे हैं कि कैसे elucidating में विशेष रूप से रुचि रखते हैं। सर्किट जटिल है, लेकिन पोषक तत्वों संवेदी उपकला कोशिकाओं कहा जाता है, enteroendocrine कोशिकाओं के साथ संपर्क में आते हैं, जहां आंत की दीवार पर शुरू होता है। इस तरह के स्वाद कोशिकाओं के रूप में अन्य संवेदी उपकला कोशिकाओं के विपरीत, enteroendocrine कोशिकाओं एक हजार 4-7 करने के लिए एक के अनुपात में पेट उपकला भर में बिखरे हैं। नतीजतन, वे पहचान और अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो गया है, और लंबे समय के लिए वे केवल पेट हार्मोन के एक स्रोत के रूप में देखा गया। लेकिन सेल विशिष्ट प्रतिदीप्ति संवाददाता चूहों के विकास के साथ, इन कोशिकाओं के जटिल संवेदी समारोह में उभर रहा है। इन संवाददाता चूहों में से एक, एक पेप्टाइड YY-GFP (PyyGFP) माउस का उपयोग करना, हम चाहते हैं कि enteroendocr पायाine कोशिकाओं हम neuropod नाम दिया है कि एक प्रमुख cytoplasmic पूंछ है। neuropods की उपस्थिति सेल करने वाली सेल संचार में एक संरक्षित समारोह का सुझाव दिया। इस प्रकार, हम एक enteroendocrine सेल के फैटी दस्तावेजीकरण द्वारा, neuropods के समारोह में प्राप्त किया जा सकता है कि समझाया।
पहचान करना मुश्किल है जो एक छितरी सेल में एक उपांग की संरचना समझने की जरूरत confocal माइक्रोस्कोपी और SBEM गठबंधन करने के लिए एक विधि विकसित करने के लिए मुख्य तर्क यह था। ब्याज की सेल PyyGFP enteroendocrine सेल विशिष्ट संवाददाता चूहों का उपयोग पहचान की थी। विधि हमें एक enteroendocrine सेल और उसके neuropod की पूरी फैटी दस्तावेज़ करने के लिए अनुमति दी। Neuropods के भीतर, हम न्यूरोनल axons की ढांचागत सुविधाओं पाया, और neuropods बाहर, हम आंतों का glia 8 के लिए एक शारीरिक संबंध पाया गया। दरअसल, neuropods इन कोशिकाओं के स्रावी समारोह में एक आवश्यक भूमिका का सुझाव सभी स्रावी vesicles के बारे में 70% होते हैं। निर्भर होनासंरचनात्मक डेटा, और हाल ही में हम इन neuropods के माध्यम से, enteroendocrine कोशिकाओं और न्यूरॉन्स पेट जीभ 8,9 में स्वाद कोशिकाओं के समान एक neuroepithelial सर्किट फार्म innervating पाया।
संरचनात्मक डेटा से उपजी जठरांत्र chemosensory तंत्र की ऐसी सुविधाओं Uncovering इस correlative माइक्रोस्कोपी विधि का उपयोग कर एकत्र हुए। हम इस विधि कोशिकाओं को एक बहुत कम अनुपात में ऊतकों के भीतर बिखरे हैं विशेष रूप से जहां कोशिका जीव विज्ञान के अन्य क्षेत्रों में उपयोगी हो सकता है। हम 3 डी (Cocem3D) में correlative confocal और धारावाहिक ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में विधि के लिए भेजा। विधि के बाद मुख्य चरण के शामिल है: ऊतक विच्छेदन, confocal माइक्रोस्कोपी, SBEM इमेजिंग, SBEM और confocal छवि सहसंबंध, और मैनुअल विभाजन। सहसंबंध शारीरिक के बजाय रासायनिक है क्योंकि अन्य correlative तरीकों की तुलना में, अवधारणा नहीं बल्कि साधारण है।
गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल chemosensation जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में एक नया रोमांचक क्षेत्र के रूप में उभर रहा है। इस वजह से enteroendocrine कोशिकाओं 18 में कार्यात्मक स्वाद रिसेप्टर्स की खोज करने के लिए महान हिस्से में है। बाद के अध्ययन enteroendocrine कोशिकाओं कार्बोहाइड्रेट, लिपिड, और aminoacids 5,6,19,20 सहित पोषक तत्वों, के लिए विशिष्ट रिसेप्टर्स व्यक्त दिखाया है। इन खोजों के लिए उत्प्रेरक कारक enteroendocrine कोशिकाओं fluorescently 20 चिह्नित कर रहे हैं, जिसमें रिपोर्टर चूहों का विकास किया गया है। हम बाहर का छोटी आंत और पेट के 17,21 के enteroendocrine कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए, इन चूहों में से एक, PyyGFP माउस का विकास किया। वे तृप्ति 22,23 के inducers हैं, जो दोनों के पी वाई वाई और ग्लूकागन-जैसे पेप्टाइड 1, स्राव करती क्योंकि ये कोशिकाएं रुचि के हैं। समय में, इन कोशिकाओं की एक पूरी अल्ट्रा संरचनात्मक खाता तो हम उन्हें उनके संकेत तंत्र को समझने के लिए आवश्यक माना गया था, जो लापता हो गया था।
"ontent> यहाँ, हम SBEM साथ confocal माइक्रोस्कोपी पाटने के लिए एक नेत्रहीन एक विधि का वर्णन किया। पद्धति हमें enteroendocrine कोशिकाओं की पूरी फैटी दस्तावेज़ करने के लिए। हम इन कोशिकाओं को तीन में शामिल है कि एक neuropod है सूचित किया है कि अनुमति दी है जो Cocem3D, के रूप में जाना जाता है कोशिकाओं enteroendocrine कि इन neuropods शारीरिक रूप से न्यूरॉन्स से कनेक्ट हालांकि स्रावी पुटिकाओं 8 के सभी के क्वार्टर। neuropod के भीतर, neurofilaments और neuronal एक्सोन ज्यादा पसंद कर रहे हैं, neuropods आंतों का glial कोशिकाओं 8 द्वारा पोषित कर रहे हैं। अधिक महत्वपूर्ण है, यह है आंत innervating और पेट के 9।Cocem3D की शक्तियों में से एक अपनी सादगी है। कोंफोकल ने उतारी और SBEM एक ऊतक के भीतर एक विशेष सेल की पहचान की सुविधा जा सकता है कि एक ब्लॉक में ऊतक के नमूने को कम करना। स्रावी vesicles और अन्य अंगों 7 एनएम / पिक्सेल के एक प्रस्ताव पर आसानी से पहचाना जा सकता है। SBEM में वर्गों खारिज कर रहे हैं, क्योंकि आगे की प्रक्रियाविशिष्ट प्रोटीन की पहचान करने के ऊतकों का गाना इस बिंदु पर एक विकल्प नहीं है। हालांकि, इस तरह के ऊतकों ब्लॉक से वर्गों संरक्षित कर रहे हैं, जिसमें Atum 24, जैसे तरीकों का विकास, सेल में विशिष्ट प्रोटीन की पहचान सकें होने की संभावना है। Enteroendocrine कोशिकाओं मस्तिष्क में आंत और तृप्ति में भोजन के बीच एक संवेदी इंटरफेस हैं क्योंकि enteroendocrine कोशिकाओं पर chemosensory रिसेप्टर्स की विशिष्ट स्थान निर्धारण, मोटापे के लिए दवा के उपचारों के विकास के लिए आवश्यक जानकारी है।
The authors have nothing to disclose.
Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Bohórquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.
Phosphate buffered saline | Life technologies | 10010023 | |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4 |
Glutaraldehyde | Sigma | G5882 | |
Dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
Low-melting agarose | Life technologies | 16520-100 | 5%, freshly made in PBS |
Standard Tissue-Tek Cryomold | Electron Microscopy Sciences | 62534-25 | |
DAPI nuclear stain | Life technologies | D1306 | |
Postively charged glass slides and coverslips | |||
Fine art paintbrush #1 | |||
Cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 11650 | |
Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21700 | |
EMbed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
Liquid releasing agent | Electron Microscopy Sciences | 70880 | |
Liquid silver colloidal | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
CircuitWorks conductive epoxy | ITW Chemtronics | CW2400 | |
Variable flow peristaltic pump | VWR | 70730-064 | |
VT1200S Vibrating blade microtome | Leica | ||
Zeiss 780i confocal microscope | Carl Zeiss | ||
Sigma VP Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss | ||
3view system | Gatan | ||
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) | http://www.renovoneural.com | Renovo provides 3d EM services | |
Fiji software | Open access software | ||
Computer station with 16GB of RAM or more | |||
Data visualization software Imaris 7.5 | Bitplane |