Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.
Avgränsning av en cells ultra är viktigt för att förstå dess funktion. Detta kan vara en skrämmande projekt för sällsynta celltyper sprids i hela vävnader gjorda av olika celltyper, såsom enteroendocrine celler i tarmepitelet. Dessa gastrointestinala sensorer av mat och bakterier har varit svår att studera eftersom de är dispergerade bland andra epitelceller i ett förhållande av 1: 1000. Nyligen har transgena reporter möss genererats för att identifiera enteroendocrine celler med hjälp av fluorescens. Ett av dessa är den peptid YY-GFP-mus. Genom att använda denna mus har vi utvecklat en metod för att korrelera konfokala och serieblock ansikte svepelektronmikroskop. Vi döpte metoden cocem3D och tillämpat det att identifiera en specifik enteroendocrine cell i vävnad och avslöja cellens ultra i 3D. Upplösningen på cocem3D är tillräcklig för att identifiera organ så små som sekretoriska vesiklar och för att skilja cellmembran för volym rendering. Cocem3D kan enkelt anpassas för att studera 3D ultrastrukturen hos andra typer specifika cell i deras naturliga vävnaden.
Livet i en cell sker i tid och rum. Förändringar över tiden är ofta studeras med time-lapse mikroskopi i kombination med fluorescens avbildningstekniker, som super-upplösning mikroskopi. Space, särskilt arrangemanget av organ inuti en cell eller cell till cell interaktioner, kan endast erhållas genom en fullständig redogörelse för cellens fin struktur. En fullständig redovisning av en cells fin struktur kan också få klarhet i genomisk funktion i de fall där genomet är tillgänglig, liksom C. elegans nematod 1 eller den platta placozoa tricoplax adherens 2. Seriell sektione elektronmikroskopi är nu en reproducerbar, tidseffektivt och mindre dyr uppgift tack vare utvecklingen av automatiserade 3D elektronmikroskopiska tekniker, såsom serieblock ansikte svepelektronmikroskopi 3 (SBEM).
Behovet av strukturell information för att belysa funktionen är mycket tydlig i vissa cell typer där funktionen beror på fysiska cell-till-cell-interaktioner, såsom neuroner, Glia, eller sensoriska epitelceller. Vi är särskilt intresserade av att belysa hur sensoriska signaler från näringsämnen i lumen i tarmen är omvandlas till en elektrisk signal som i slutändan modulerar appetitive beteenden. Kretsen är komplex men börjar vid väggen i tarmen där näringsämnen kommer i kontakt med sensoriska epitelceller, kallade enteroendocrine celler. Till skillnad från andra sensoriska epitelialceller, såsom smakceller, är enteroendocrine celler dispergerade genom tarmepitelet vid ett förhållande av 1 till 1000 4-7. Följaktligen har de varit svåra att identifiera och studera, och under lång tid de sågs bara som en källa till tarmhormoner. Men med utvecklingen av cellspecifika fluorescens reporter möss, är den komplexa sensorisk funktion hos dessa celler att växa fram. Med hjälp av en av dessa reporter möss, en peptid YY-GFP (PyyGFP) mus, fann vi att enteroendocrINE-celler har en framträdande cytoplasmasvans som vi döpte neuropod. Utseendet på neuropods föreslog en konserverad funktion i cell-till-cell-kommunikation. Således resone vi att genom att dokumentera ultrastrukturen av en enteroendocrine cell, vars funktion neuropods kunde härledas.
Behovet av att förstå strukturen av ett bihang i en spridd cell som är svårt att identifiera var det huvudsakliga skälet till att utveckla en metod för att kombinera konfokalmikroskopi och SBEM. Cellen av intresse identifierades med användning PyyGFP enteroendocrine cellspecifika reporter möss. Metoden tillät oss att dokumentera hela ultra av en enteroendocrine cellen och dess neuropod. Inom neuropods, fann vi strukturella drag av neuronala axoner, och utanför neuropods, fann vi en fysisk relation till enter glia 8. I själva verket, neuropods innehåller ca 70% av alla sekretoriska vesiklar antyder en viktig roll i den sekretoriska funktion av dessa celler. Att bygga påstrukturdata, mer nyligen visade det sig att genom dessa neuropods, enteroendocrine celler och neuroner som innerverar tarmen bilda ett neuroepiteliala krets, liknande den i smakceller i tungan 8,9.
Avslöjande sådana funktioner av gastrointestinala chemosensory mekanismer härrörde från struktur uppgifter som samlats in med hjälp av denna korrelat mikroskopi metod. Vi tror att denna metod skulle kunna vara användbara inom andra områden av cellbiologi, särskilt när celler är dispergerade i vävnaderna vid ett mycket lågt förhållande. Vi hänvisade till metoden som korrelat konfokala och serieblock ansikte svepelektronmikroskop i 3D (Cocem3D). Metoden består av följande huvudsteg: vävnad dissektion, konfokalmikroskopi, SBEM bildbehandling, SBEM och konfokal bild korrelation, och manuell segmentering. Jämfört med andra korrelativa metoder, är begreppet ganska enkel eftersom korrelationen är fysisk snarare än kemisk.
Gastrointestinal chemosensation framstår som ett spännande nytt område inom biomedicinsk forskning. Detta är till stor del på grund av upptäckten av funktionella smakreceptorer i enteroendocrine celler 18. Efterföljande studier har visat att enteroendocrine celler uttrycker specifika receptorer för näringsämnen, inklusive kolhydrater, lipider och aminosyror 5,6,19,20. Den katalytiska faktorn för dessa upptäckter har varit utvecklingen av reporter möss, i vilka enteroendocrine celler är fluorescensmärkt 20. Vi utvecklade ett av dessa möss, den PyyGFP musen, för att studera enteroendocrine cellerna i distala tunntarmen och tjocktarmen 17,21. Dessa celler är av intresse eftersom de utsöndrar PYY och glukagon-liknande peptid 1, som båda är inducerar mättnad 22,23. Vid den tiden, en komplett ultra-strukturell hänsyn till dessa celler saknades, som vi trodde var viktigt att förstå deras signaleringsmekanismer.
INNEHÅLL "> Här har vi beskrivit en visuellt en metod för att överbrygga konfokalmikroskopi med SBEM. Metoden kallat Cocem3D, som tillät oss att dokumentera hela ultra av enteroendocrine celler. Vi har rapporterat att dessa celler har en neuropod som innehåller tre fjärdedelar av alla de sekretoriska vesiklar 8. Inom neuropod finns neurofilament och likt neuronala axoner, är neuropods näring av enter gliaceller 8. Ännu viktigare, är det dock dessa neuropods som enteroendocrine celler ansluta fysiskt till nervceller innervating tarmen och kolon 9.En av styrkorna med cocem3D är dess enkelhet. Att minska vävnadsprovet i ett block som kan avbildas genom konfokal och SBEM underlättar identifieringen av en specifik cell i en vävnad. Sekretoriska blåsor och andra organeller kan identifieras med lätthet med en upplösning på 7 nm / pixel. Eftersom avsnitten i SBEM kasseras, ytterligare processjunga av vävnader för att identifiera specifika proteiner är inte ett alternativ på denna punkt. Men utvecklingen av metoder såsom ATUM 24, i vilka sektioner från vävnadsblocket bevaras, kommer sannolikt att möjliggöra identifiering av specifika proteiner i cellen. Att bestämma den särskilda platsen för chemosensory receptorer på enteroendocrine celler är väsentlig information för utvecklingen av läkemedelsterapier för fetma, eftersom enteroendocrine celler är en sensorisk gränssnitt mellan mat i tarmen och mättnad i hjärnan.
The authors have nothing to disclose.
Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Bohórquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.
Phosphate buffered saline | Life technologies | 10010023 | |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4 |
Glutaraldehyde | Sigma | G5882 | |
Dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
Low-melting agarose | Life technologies | 16520-100 | 5%, freshly made in PBS |
Standard Tissue-Tek Cryomold | Electron Microscopy Sciences | 62534-25 | |
DAPI nuclear stain | Life technologies | D1306 | |
Postively charged glass slides and coverslips | |||
Fine art paintbrush #1 | |||
Cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 11650 | |
Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21700 | |
EMbed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
Liquid releasing agent | Electron Microscopy Sciences | 70880 | |
Liquid silver colloidal | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
CircuitWorks conductive epoxy | ITW Chemtronics | CW2400 | |
Variable flow peristaltic pump | VWR | 70730-064 | |
VT1200S Vibrating blade microtome | Leica | ||
Zeiss 780i confocal microscope | Carl Zeiss | ||
Sigma VP Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss | ||
3view system | Gatan | ||
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) | http://www.renovoneural.com | Renovo provides 3d EM services | |
Fiji software | Open access software | ||
Computer station with 16GB of RAM or more | |||
Data visualization software Imaris 7.5 | Bitplane |