We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.
Et af de vigtigste processer inflammation er infiltrering af immunceller fra lumen i blodkarret til det omgivende væv. Dette sker, når endotelceller, der beklæder blodkar, bliver klæbemiddel på cirkulerende immunceller såsom monocytter. In vitro måling af denne klæbeevne har indtil nu været udført ved at kvantificere det samlede antal monocytter, der overholder et endothellag enten som en direkte tælling eller ved indirekte måling af fluorescensen af adhærerende monocytter. Mens sådanne målinger gør angive den gennemsnitlige klæbeevne af endotelcelle befolkning, er de forstyrret af en række faktorer, såsom celletal, og afslører ikke andelen af endotelceller, der faktisk klæbemiddel. Her beskriver vi og udviser en fremgangsmåde, der tillader opregningen af klæbende celler i en population af testede endotel monolag. Endotelceller dyrkes på dækglas og følgende ønskesbehandling udfordres med monocytter (der kan være fluorescerende mærket). Efter inkubation en skylning procedure, der involverer multiple runder af nedsænkning og dræning, fikseres cellerne. Selvklæbende endotelceller, som er omgivet af monocytter let identificeret og talt, hvilket giver en vedhæftning indeks, der afslører den faktiske andel af endotelceller i populationen, der er klæbende.
Infiltration af immunceller såsom monocytter tværs endothelcellelaget at linje blodkar er et vigtigt skridt i processen med inflammation 1. Dette gør det muligt homing af immunceller (immunocytter) til en skadestedet. I andre tilfælde og steder som kranspulsåren og halspulsåren, kan infiltration af monocytter gennem endothellaget føre til uønskede fastboende af disse celler i væggen af arterien, hvilket potentielt kan føre til dannelsen af plaques 2. I alle tilfælde af immunocyt infiltration, det første trin involverer aktivering af endotelceller i et lokaliseret område af blodkarret. Endotelceller aktiveres af proinflammatoriske cytokiner såsom TNF-α og IL-6 for at forøge ekspression af celleoverflade- proteiner, såsom VCAM, ICAM og E-selectin, som letter rekrutteringen og fastgørelse af immunocytter på endotelcelleoverfladen 3- 6.
<p class = "jove_content"> Oprindeligt måling af endotelcelleadhæsion blev udført ved at tælle monocytter, der adhærerede til endotelceller monolag 7. Begrænsningerne ved denne fremgangsmåde i form af præcision ført til anvendelse af radioaktivt mærket lymfocyt eller monocyt, efterfulgt af kvantificering af radioaktive stoffer, der svarer til lymfocytter eller monocytter vedhæftning 4. Denne metode blev til sidst erstattet af en fluorescens-baseret metode, hvorved immunocytter af interesse blev mærket med fluorescens farvestof og underkastes den samme fremgangsmåde som ovenfor med den forskel, at fluorescens i stedet for radioaktivitet måles 8. For tiden denne metode har vist sig som den mest bekvemme og sælges som sæt af en række kommercielle leverandører. Mens dette assay kan måle relative niveauer af klæbeevne mellem kontroller og eksperimentelle prøver, betyder det ikke afsløre, om en ændring i fluorescens skyldes en ensartet ændring i klæbeevnen på tværs af hele endothelial cellepopulation eller hvis ændringen skyldes en forskel på klæbeevne inden en sub-population af celler. Det er også klart, at strengheden af vask udøver en dybtgående indvirkning på resultatet, og endnu vigtigere, vil ensartetheden af skylning ubundne monocytter mellem forskellige endotel cellemonolag stor indflydelse på graden af resultater fra gentagelser og reproducerbarhed af resultaterne mellem prøverne . For nylig blev adskillige systemer, som pumper monocytter i medier på tværs af en endotelcelle monolag anvendes til at løse dette problem 9. Desuden er disse flowsystemer også rekapitulere effekten af forskydningskraften på endothelcellerne. Mens fordelene ved sådanne systemer er klare og meget attraktivt, er det også vigtigt at indse, at mens endotelcelle klæbeevne kan blive kraftigt forøget, som det er tilfældet i akut inflammation, af faktorer, såsom TNFa, nogle andre aktivatorer, såsom ioniserende stråling 10 fremkalder ændrer that er ikke let påvises inden in vitro eksperimentelle tidsrammer, som disse meget strenge systemer. Mens sådanne minut ændringer af endotelceller klæbeevne let er savnet eller afskediges in vitro, er det ikke nødvendigvis godartet in vivo, hvor sådanne små ændringer inden for en levetid, som er karakteristisk for kronisk inflammation, kan udøve meget betydelige resultater. Derfor er en robust, men alligevel følsomt, og metode til at påvise og måle er brug endothelcelle klæbeevne.Her rapporterer vi en metode til at måle klæbeevne af endotelceller direkte. Denne metode er ikke afhængig af fluorescens måling som en indirekte surrogat indikator for endotelceller klæbeevne. Det afslører, om ændringer i klæbeevne skyldes ensartet ændring i alle celler eller begrænset til en sub-population. Herudover giver det co-farvning af endotelceller med markører, såsom senescens-associerede beta-galactosidase, cellelevedygtighed marker, Calcien AM og antistoffer mod celleoverflade og intracellulære proteiner, der muliggør associering af individuelle adhæsive endotelceller til visse celletilstande eller ekspression af specifikke proteiner.
Den monocytadhæsion assayet beskrevet ovenfor blev anvendt med succes i eksperimenter designet til at studere de biologiske virkninger af ioniserende stråling på endotele monolag 10. Selvom dette ikke er den eneste metode til at vurdere klæbeevnen af en endotel monolag, det er den eneste metode, der tillader kvantificering af andelen eller procentdelen af endotelceller i et monolag, der er klæbende. Dette er en vigtig forskel som en global kvantitativ ændring i adhæsion af monocytter, kan som målt ved andre metoder enten henføres til en generel stigning i klæbeevne af alle celler i det endotele monolag eller for øget klæbeevne af en sub-population af endotelceller inden monolaget, som vist i ovenstående eksempel. Værdien af at have denne information er eksemplificeret ved det forhold, at evnen til at kvantificere procentdelen af endotelceller, der udviste forbedret klæbeevne efter bestråling førte til de inesstand konklusion, at denne virkning ikke skyldes genetisk mutation af et bestemt gen som den procentdel af celler, der var klæbemiddel var langt over (over 1000 gange mere), som ville forventes fra tilfældig mutation af et gen af X-stråling ved denne dosis .
Den faktor, der tillader god reproducerbarhed af resultaterne er vask regime. Som vaskeproceduren involverer neddypning af dækglas i vaskepuffer efterfulgt af duppe på et væv, er variabiliteten i bufferen turbulens, som uundgåeligt opstår fra den gamle metode til pipettering i vaskepufferen i en brønd undgås. Ja det var observation af overdreven variation mellem replikater opnået ved hjælp af den pipettering metode, der tvang os til at udtænke en vask procedure, der fjernede variabilitet element fra vask trin.
Ganske vist af begrænsninger i denne analyse ligger i behovet foretage manuel optælling af monocyt klynger, der gør not lade det være indrettet til high throughput analyser. For det andet, at beslutningen om, hvor mange monocytter udgør en klynge skal bestemmes semi-vilkårligt, og niveauet kan være indstillet for højt, og resultere i udelukkelse af nogle ægte klynger. Manglen på forskydningskraft i denne fremgangsmåde kan også ses som en begrænsning i forsøg, hvor groft forbedret klæbeevne af endotelceller induceres (f.eks + TNFa). I andre situationer imidlertid manglen på forskydningskraft er en fordel, da den tillader påvisning af mindre overdrevet forøgelse af klæbeevnen. Beskeden stigning i monocyt klæbeevne kan være særlig vigtig og relevant. In vivo monocytter ville ikke (i en typisk eksperimentel tid) forventes at vedhæfte i stort tal til endotelceller med beskeden stigning i klæbeevne, hovedsagelig på grund af forskydning kraft. Med tiden dog nogle monocytter sandsynligvis ville, og det er mere sandsynligt, at repræsentere miljøet af kronisk inflammation. Som sådan,fraværet af forskydningskraft kan være en fordel, da det giver mulighed for små stigninger i endotelcelle klæbeevne til at åbenbares i eksperimentelle tidsrammer som typisk korte og muligvis for flygtig til at tillade beskedne stigning i klæbeevne skal overholdes under forskydningsspænding.
Evnen til at underkaste cellerne efter dette assay til andre analyser, såsom ældning assay og immunofluorescensfarvning øger anvendeligheden af denne metode som den muliggør associering af klæbeevne af specifikke endotelceller til bestemte cellulære proteiner eller cellulære tilstande som påvist ovenfor, en funktion, er ikke tilgængelig med de ældre adhæsionsassays.
Denne fremgangsmåde er blevet anvendt med est2-immortaliserede humane koronare endotelceller og lignende resultater blev også opnået med primære humane koronare endotelceller 10, hvilket viser, at det ikke er specifik for kun en bestemt cellelinie. Også den adoptio n af denne fremgangsmåde til analyse klæbeevne af endotelceller udelukker ikke underkaste de samme celler til den standard adhæsion assay, der måler fluorescens af mærkede immunocytter. Sammen denne rapport viser, at denne metode er alsidig, inkluderende og giver meget mere information end den standard vedhæftning analysen.
The authors have nothing to disclose.
We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Glass coverslips Round 12mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
RPMI | Sigma | R8758 | |
Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
Fibronectin | Sigma | F0895 |