In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
Under många år har forskning kring neurodegenerativa tillstånd som ischemisk stroke eller traumatisk hjärnskada fokuserad på utveckling av neuroprotektiva terapier som syftar till att främja neuronal överlevnad i akut stroke fasen. Den stora majoriteten av läkemedelsterapier som har befunnits vara effektiv i gnagarmodeller misslyckats vid omräkning till kliniken. Orsaker till detta terapeutiska misslyckande inkluderar men är inte begränsade till bristen av fördröjd läkemedelseffekter som resulterar i ihållande funktionell neurologisk återhämtning. Det är därför viktigt att utveckla strategier för att främja hjärnan ombyggnad på längre sikt. Eftersom främjandet av neuronal överlevnad ensam är inte tillräcklig för att möjliggöra en framgångsrik stroke återvinning, som föreslagits av det stora antalet misslyckade neuroprotektion prövningar stimulering av neuronal plasticitet har nyligen erhållit ett stort intresse inom området.
Medel för läkemedelsleverans är intraperitoneal injektion, svans intravaskulär injection, lårbens injektion, enda stereotaktisk injektion av vektorer i hjärnan och fortsatt konstant leverans av miniosmotiska pumpar. Den senare kan inkludera systemisk tillförsel, om pumpen inte har en kanyl, eller som kan organriktad, såsom vi har visat för leverans till hjärnan. Med undantag för miniosmotiska pumpar och användningen av virala vektorer, kommer alla andra strategier inducerar fluktuerande läkemedelskoncentrationer. För långtidsförsök blir det därför nödvändigt att lägga fram djuret till stressen att ta emot frekventa injektioner. BBB innebär ett viktigt hinder för hjärnans upptag av proteiner eller läkemedel från blodet, vilket resulterar i behov av stora protein eller läkemedelsdoser för att uppnå terapeutiska koncentrationer i hjärnan. Till exempel Pellegrini et al. (2013) 5 levereras rhEPO genom intraperitoneal injektion i en dos motsvarande 75 IE / dag för ett djur av 30 g (750 IE / dag för en 300 g råtta). I jämförelse, den riktade leveransen av rhEpo till hjärnan tillät oss att använda en mycket lägre dos av bara 10 IU / dag i vår studie för en lyckad stroke återvinning, som gjorde det möjligt för oss att uppnå återhämtning över ett stort tidsskala med en fast ränta på 0,25 ul / h.
I detta arbete har vi visat metoden för implantering av minipumpar med en kanyl ansluten till skallen för att leverera plasticiteten gynnande proteinet rhEPO direkt in i ventrikeln, på så sätt kringgå BBB. Genom denna metod, rhEPO främjade neurologisk återhämtning i ett antal olika sätt, inklusive reduktion av infarktstorlek, reduktion av gliaceller ärrbildning och induktion av angiogenes. rhEPO främjade också neuronal överlevnad och ökad prognoser från contralesional motoriska cortex mot denerverade röda kärnan och ansikts kärnor. Groning av fibrerna avslöjades genom injektion av anterovägarna spår BDA i motoriska cortex (figurerna 4A och 5A). En funktionell korrelat till groning av fibrerna är provided genom förbättringen av motorik (figur 5B). Dessutom har vi visat att kan tillämpat samma tillvägagångssätt för tarmkanalen spår injektion för att avslöja thalamo-kortikala förbindelser med injektion av bakåtsträvande vägarna spår FG (figur 6B).
Vid framställningen av den miniosmotiska pump, är det viktigt att ta hänsyn till målpunkten och användning av distanser. Vi använder ett distanselement för att minska längden på nålen genom att 0,5 mm som på detta sätt den yttersta spetsen av nålen är i kontakt med kammaren på de angivna koordinaterna (-0,2 mm caudal, 0,9 mm lateralt, 2,5 mm dorso ventrala, med avseende på bregma). Men om djupare strukturer är målet för forskning, då kommer att behövas några distanser. Likaså om en mer extern utlämningsställe önskas (dvs., Cortex), sedan flera distans skivor kommer att bli nödvändiga. Katetern måste vara tillräckligt lång så att pumpen inte är för nära huvudet, eftersom det kommer att hindra rörelser av mouse, men inte heller alltför länge en gång implanterats alltför lång tid kan leda till att katetern att böjas, vilket ökar risken för kanyl avlägsnande av den naturliga rörelsen hos musen. En sektion av 2 cm av katetern ger mycket goda resultat i form av rörlighet och stabilitet av implantatet (fig 1 och 2). Inkubation av pumpen vid 37 ° CO / N gör att pumpen omedelbart börja pumpa läkemedlet in i hjärnan vid tidpunkten för implantering.
I miniosmotiska pump implantationen är det kritiskt att säkerställa att skallen är ordentligt torkas innan implantering kanylen. Vanligtvis rengöring med 70% etanol kommer att framkalla benet för att torka, men om kontinuerlig blödning hittas, röra skallen försiktigt med en cauterizer kommer att helt torka. Det är kritiskt för att säkerställa att införandet av nålen är så vertikalt och långsam som möjligt. Väl på plats, och medan limmet torkar, placera fingret på toppen av kanylen hindrar den från att röra sig i sidled over skallen. Särskild försiktighet bör ägnas åt såret och placeringen av kanylen. Det är viktigt att snittet inte utförs exakt över mittlinjen av skallen men något till den högra sidan. Vid stängning av såret, om snittet gjordes vid mittlinjen, kommer huden att vara överbelastade, vilket ökar risken för lindad öppning. Making snittet lite åt sidan kommer att tillåta suturen punkterna att vara borta från den högsta delen av kanylen. Som en följd kommer det att finnas mindre spänning på suturen poäng och såret kommer läka ordentligt. Djuren bör bur ensam och kontrolleras varje dag, speciellt under de första 10-15 dagar efter implantation. Vid sårruptur, sår måste stängas så snart som möjligt. Om kanylen avlägsnas eller ett djur påvisar en infektion, har försöket att avslutas. Re-implantation av kanylen rekommenderas inte. Det är mycket viktigt för en lyckad implantation att använda tillräckliga mängder av vävnads annonshesive (inte för mycket!) som det bryts ned benet och ökar risken för kanyl borttagning. Men med hjälp av för lite lim kommer inte heller att hålla kanylen fäst till benet. De miniosmotiska pumpar kan bära läkemedel lösta i ett stort antal olika ämnen, som är den enda begränsningen till detta att lösningsmedlet är biokompatibla. Dessutom, med tanke på att volymen är liten (200 ^ il) en måste avgöra huruvida den koncentration som krävs för experimentet är lämplig och kommer inte att orsaka utfällning inuti pumpen.
Tract spårning med antingen antero eller bakåtsträvande spårämnen är en mycket väl etablerad teknik för att studera hjärnans anslutning och plasticitet. Man måste ges till användning stereotaktisk ramar när du injicerar för att säkerställa exakthet på inriktning på hjärnans område man vill studera (det vill säga, för att förhindra injektion i corpus callosum vid injektion cortex).
För alla kirurgiska ingrepp och för att minska smärta ochinflammation, bör djuren behandlas med 0,1 mg / kg Buprenorfin före interventionen och Caprofen vid 4 mg / kg en gång dagligen under tre dagar efter insatsen.
Sammanfattningsvis ger detta tillvägagångssätt en riktig verktyg för att studera effekten av proteiner eller farmakologiska föreningar i den skadade hjärnan, vilket motsvarar en metod som är väl lämpad för studier av hjärnans plasticitet.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |