Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.
Neutrofiler, den mest rigelige af alle hvide blodlegemer i den humane cirkulation, spiller en vigtig rolle i værtens forsvar mod invaderende mikroorganismer. Desuden neutrofiler spiller en central rolle i immunovervågning af tumorceller. De har evnen til at genkende tumorceller og inducere tumor celledød enten gennem en celle kontakt-afhængig mekanisme, der involverer hydrogenperoxid eller via antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet (ADCC). Neutrofiler med antitumoraktivitet kan isoleres fra perifert blod fra cancerpatienter og tumorbærende mus. Benævnes disse neutrofiler tumor-indblandet neutrofiler (TEN) for at skelne dem fra neutrofiler af raske personer eller naive mus, der viser ingen signifikant tumor cytotoksisk aktivitet. Sammenlignet med andre hvide blodlegemer, neutrofiler vise forskellige opdrift, hvilket gør det muligt at opnå en> 98% rent neutrofil befolkning, når de underkastes en densitetsgradient. Men ud overtil den normale høj massefylde neutrofil population (HDN), hos cancerpatienter, i tumorbærende mus, samt under kroniske inflammatoriske tilstande, distinkte lav densitet neutrofile populationer (LDN) fremgår kredsløbet. LDN co-oprenses med fraktionen mononukleare og kan adskilles fra mononukleære celler ved anvendelse af enten positiv eller negativ udvælgelse strategier. Når renheden af de isolerede neutrofiler bestemmes ved flowcytometri, kan de anvendes til in vitro og in vivo funktionelle assays. Vi beskriver teknikker til overvågning af anti-tumor aktiviteten af neutrofiler, deres evne til at migrere og til at producere reaktive oxygenarter, såvel som overvågning af deres fagocytiske kapacitet ex vivo. Vi beskriver yderligere teknikker til at mærke de neutrofile til in vivo sporing, og til at bestemme deres anti-metastatiske kapacitet in vivo. Alle disse teknikker er afgørende for at forstå, hvordan du anskaffer og karakterisere neutrofiler med anti-tumorfunktion.
Neutrofiler blev indledningsvist karakteriseret som medfødte immunceller, der tjener som første linje forsvar mod invaderende mikroorganismer. I dag er det kendt, at neutrofiler har mere vidtrækkende funktioner, være involveret i montering adaptive immunrespons mod fremmede antigener 1,2, regulering hematopoiese 3, angiogenese 4 og sårheling 5. Derudover kan neutrofiler påvirke tumorvækst og metastatisk progression i kraft af deres pro- og anti-tumor aktiviteter 6,7. Neutrofiler er karakteriseret ved en polymorf segmenteret kerne (betegnet dermed polymorfonukleære (PMN) leukocytter) og indeholder mindst tre forskellige underklasser af granulater samt sekretoriske vesikler 8 (figur 1A-C).
Neutrofiler besidder høj fagocytisk kapacitet og høj NADPH-oxidase-aktivitet kritisk for mikrobiel elimination, og udskiller en bred vifte af chemokiner vigtige itrækkraft yderligere neutrofiler og andre immunceller til stedet for inflammation 8,9. Neutrofiler er karakteriseret ved ekspression af en stor mængde af overfladereceptorer herunder Toll-lignende receptorer (TLRs), C-type lectin Receptorer (CLR'er), komplement receptor 3 (CD11b / CD18) og andre adhæsionsmolekyler (fx L-selectin, LFA-1, VLA-4 og carcinoembryonisk antigen-relateret celleadhæsionsmolekyle 3 (CEACAM3 / CD66b)), kemokinreceptorer (f.eks CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), kemotiltrækkende receptorer (f.eks PAFR, LTB4 R og C5aR) , cytokin-receptorer (f.eks G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptid-receptorer (f.eks FPR1-3), og Fc-receptorer (f.eks CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) og CD64 (FcyRI) 10. Hos mus er neutrofiler normalt identificeret som CD11b + Ly6G +, mens humane neutrofiler identificeres ved hjælp af CD11b, CD15, CD16 og CD66b leukocyt markører. Det er også generelt accepteret at farvning for granulatet proteiner myeloperoxidase (MPO) og neutrofil elastase (NE) til påvisning af neutrofiler i væv.
Det er stadig uklart, om de forskellige funktioner af neutrofiler medieres af den samme celle eller ved distinkte celle subpopulationer. Akkumulerende data tyder for tilstedeværelsen af en heterogen neutrofil population, som udviser en høj grad af plasticitet påvirket af proinflammatoriske stimuli og mikromiljøet 11,12. Fridlender et al. 13 har groft opdelt neutrofiler i kræft i to store delpopulationer betegnes N1 med anti-tumor egenskaber og N2 med pro-tumor egenskaber. I kræft, såvel som i kronisk inflammation, der er en ekstra sub-population bestående af granulocytiske myeloide-afledte suppressorceller (G-MDSCs), der undertrykker T-cellereaktioner 14. G-MDSCs anses for at være umodne myeloide celler er karakteriseret ved en CD11 + Ly6Clav Ly6G hi fænotype i mus 15, og samtidig have en CD15 + / CD16 lav fænotype i humane 16. G-MDSCs ekspres højere niveauer af arginase og myeloperoxidase, medens lavere niveauer af cytokiner og chemokiner end normale cirkulerende neutrofiler. De er mindre fagocyterende og vandrende, men producerer højere niveauer af ROS 15,17,18. I det foreliggende dokument vil vi beskrive nogle grundlæggende metoder til isolering og karakterisering af neutrofiler med anti-tumor egenskaber.
Mens neutrofiler udgør den største bestand af alle hvide blodlegemer i menneskets omløb (45-70%, 1.800 – 6.000 / ul), i mus, under normale forhold, de er temmelig sparsomme (10 – 15%; 300-500 / ul ). Neutrofiltallet stiger støt upon inflammation og lejlighedsvis i kræft, hvilket er en tilstand af kronisk inflammation 7. Neutrofiler udvikle sig fra multipotente fælles myeloid forløber (CMP) ceLLS i knoglemarven, gennem en differentiering proces passerer faser af Myeloblaster (MB), promyelocytter (PM), myelocytter (MC), metamyelocytes (MM) og band-celler (BC) 8. De modne, post-mitotiske neutrofiler kan forblive inden knoglemarven til 4 – 7 dage før de frigives til kredsløbet 8. Neutrofil omsætning i blodet er normalt hurtig med en gennemsnitlig halveringstid på 6-12 timer, hvilket kan forlænges under inflammatoriske tilstande. Stimulerede neutrofiler har begrænset anti-tumorigen aktivitet, en funktion, der kan erhverves ved at udsætte naive neutrofiler til chemokinerne IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 og CXCL5 6,19 eller kunstigt, ved at udsætte dem for phorbolesteren phorbol-12 -myristate 13-acetat (PMA) 6.
Den korte halveringstid af blodneutrofiler sammen med det lave antal neutrofiler (~ 3-5 x 10 5) opnået fra 1 ml blod fra en naiv 6 – 8 uger gamle mus, har gjort detvanskeligt at udforske funktionen af cirkulerende muse neutrofil in vitro. At overvinde denne vanskelighed, er blevet anvendt andre kilder. For eksempel kan et stort antal neutrofiler opnås fra knoglemarven 20 eller peritoneum efter induktionen af steril inflammation (fx efter intraperitoneal injektion af thioglycollat bouillon eller Zymosan A). Det skal bemærkes, at neutrofiler opnået fra bughulen ikke udøve nogen anti-tumorigen aktivitet (upubliceret observation).
. Granot et al 6 observeret, at BALB / c-mus inokuleret orthotopisk med musen 4T1 brystcarcinoma-cellelinie udvikle neutrofili hvilket forværrer med tumorprogression 6 (figur 2A), således at 20 til 40.000.000 blodneutrofiler let kan isoleres fra 1 ml blod 3 – 4 uger efter tumorpodning. Disse neutrofiler har erhvervet anti-tumor aktiviteter og har derfor været COIdefinerede tumor-indblandet neutrofiler (TEN), for at skelne dem fra naive neutrofiler 6 (figur 2B). Mens høj tæthed neutrofiler (HDN, figur 1A) er yderst anti-tumorigen, low-density neutrofiler (LDN, figur 1B), der genereres i forbindelse med cancer, er ikke 21. Også, high-density neutrofiler fra knoglemarven og milten af tumorbærende mus har anti-tumor aktivitet (upublicerede data). Det skal bemærkes, at med tumorudvikling milten bliver gradvist forstørret (splenomegali), med stigende mængder af neutrofiler.
Det skal bemærkes, at TEN også genereres i andre modeller af cancer, herunder både spontane (MMTV-PyMT og MMTV-Wnt1 brysttumorer og K-Ras drevne lungetumorer) og injiceret (AT-3 (MMTV-PyMT) og E0771 brystcarcinom celler, LLC Lewis lungecarcinomceller og B16-F10 melanomceller). Imidlertid er omfanget af neutrofil tilvejebringelse i disse tumeller modeller er langt mindre end af 4T1-inokulerede mus og nåede 5 – 10 x 10 6 neutrofiler i 1 ml blod efter 3 uger.
Neutrofiler er de mest talrige af alle hvide blodlegemer og er de første respondenter i tilfælde af infektion og inflammation. Som sådan er de yderst følsomme over for eksterne signaler og er let aktiveres. Desuden neutrofiler har en meget kort halveringstid og en hurtig omsætning. Tilsammen udgør disse karakteristika rejser flere problemer i at arbejde med neutrofiler, således at der kræves unikke eksperimentelle strategier. For eksempel er der flere neutrofile rensning strategier, hver med sine egne fordele og…
The authors have nothing to disclose.
ZG er støttet af tilskud fra I-CORE program Israel Science Foundation (Grant nr 41/11), den Abisch-Frenkel Foundation, Rosetrees Trust, Israel Cancer Research Foundation (ICRF – Forskning Karriereudvikling Award) og CONCERN fundament. ZGF er støttet af tilskud fra Israel Cancer Research Foundation (ICRF – Forskning Career Development Award), Chief Scientist i Israel Ministeriet for Sundhed og Israel Lung Association.
CELL LINES | |||
Mouse 4T1 breast carcinoma cells | ADCC | CRL-2539 | Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS |
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
24-well Tissue Culture Plate | Falcon | 353047 | Sterile |
100 mm Tissue Culture Plate | Corning | 430167 | Sterile |
25 cm2 Tissue Culture Flask | Nunc | 156340 | Sterile |
90 mm Bacterial Grade Culture Dish | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 20090-01-017 | Sterile |
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 835015-40-111 | Sterile |
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 835050-21-111 | Sterile |
Falcon 12×75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube | Becton Dickinson | 352058 | Sterile |
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm | Merck Millipore | PSMT010R1 | Sterile |
White 96-Flat-Bottom Well Plate | Costar | 3917 | Sterile |
Cell Strainer (40 mm) | BD Falcon | 352340 | Sterile |
20G 1.5" Needle | BD Microlance 3 | 301300 | Sterile |
23G 1" Needle | BD Microlance 4 | 300800 | Sterile |
25Gx5/8" Needle | BD Microlance 5 | 300600 | Sterile |
0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle | BD Micro-Fine Plus Demi | 320829 | Sterile |
9 mm Clips | BD, AutoClip | 427631 | Sterile |
EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | |
MACS LS Separation Column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | Sterile |
MidiMACS Separator Magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
Microscope Glass Slide | Menzel-Gläser Superfrost Plus Thermo | J1800AMNZ | |
Orbital Shaker | Sky line, ELMI | S-3.02.10L | |
Plate Reader | TECAN | InfiniteF200Pro | |
POWDER | |||
Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Sigma | A7906 | |
Bromodeoxyuridine (BrdU) | BD Pharmingen | 550891 | Sterile |
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) | Molecular Probes | C1157 | |
Dextran T500 | Sigma | 31392 | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
Sodium azide (NaN3) | Sigma | S8032 | Highly toxic, handle with care |
Thioglycollate powder | Difco | 225650 | |
Zymosan A | Sigma | Z4250 | |
MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Sigma | D5796 | Sterile |
Opti-MEM® I reduced serum medium | Life Technologies | 31985062 | Sterile |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | Sterile |
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated | Sigma | F9665 | Sterile |
L-Glutamine | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-020-1A | Sterile |
Sodium pyruvate | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-042-1B | Sterile |
Penicillin Streptomycin x1000 solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-031-5 | Sterile |
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+ | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-023-1 | Sterile |
PBSx10 without Ca2+ and Mg2+ | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-023-5A | Sterile |
HPLC grade water | J.T. Baker | 4218-03 | Autoclave |
SOLUTIONS | |||
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium | Life Technologies | A10492-01 | |
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS | Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter. | ||
CFSE, 5 mM in DMSO | Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC. | ||
Eosin Y solution | Sigma | HT110-2-32 | |
Hanks' balanced salt solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
Heparin, 20 mg/ml in PBS | Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
Histopaque-1119 | Sigma | 11191 | Sterile filter through a 0.2 mm filter. |
Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Sterile filter through a 0.2 mm filter. |
Luciferase cell culture lysis buffer x5 | Promega | E153A | Dilute 1:5 in sterile water just before use. |
Luciferase assay solution | Promega | E1501 | Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A) |
Mayer's Hematoxylin solution | Sigma | MHS-32 | |
PBS+0.5% BSA | Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
PBS+1% BSA | Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
5x PBS with 2.5% BSA | Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA | Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) | Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
Saline (0.9% NaCl) | Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
0.2% NaCl solution | Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
1.6% NaCl solution | Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
2 % Sodium azide | Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic. | ||
3% Thioglycollate solution | Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw. Boil until solution becomes yellow and autoclave. | ||
Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution. |
Trypsin solution B | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-046-1 | Sterile |
1 mg/ml Zymosan A | Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use. | ||
KITS | |||
EasySep PE selection kit | STEMCELL Technologies | 18557 | |
EasySep PE selection cocktail | STEMCELL Technologies | 18151 | |
the EasySep magnetic nanoparticles | STEMCELL Technologies | 18150 | |
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-332 | |
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19762 | |
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19257 | |
FITC BrdU flow kit | BD Pharmingen | 559619 | |
MACS Neutrophil isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-097-658 | |
Phagocytosis Assay Kit | Cayman Chemical Company | 500290 | |
ANTIBODIES | |||
FcR blocking antibody | Biolegend | 101302 | |
Purified rat anti-Ly6G antibody | BD Pharmingen | 551459 | Clone 1A8 |
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody | Biolegend | 127608 | Clone 1A8 |
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G | BD Pharmingen | 551460 | Clone 1A8 |
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 65-1276 | Clone 1A8 |
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 75-1276 | Clone 1A8 |
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b | BD Pharmingen | 553310 | Clone M1/70 |
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) | BD Pharmingen | 553127 | Clone RB6-8C5 |
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 553081 | Clone 30-F11 |
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80 | Abcam | ab60343 | Clone BM8 |
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b | Biolegend | 305103 | Clone G10F5 |
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k) | BD Pharmingen | 553927 | Clone R35-95 |
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11 |