Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties

Summary

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Abstract

Neutrofielen, de meest voorkomende van witte bloedcellen in de menselijke circulatie, spelen een belangrijke rol bij de afweer tegen binnendringende micro-organismen. Bovendien neutrofielen spelen een centrale rol in de immuunbewaking van tumorcellen. Ze hebben het vermogen om tumorcellen te herkennen en te induceren tumorceldood hetzij door een cel contact-afhankelijke mechanisme met waterstofperoxide of door middel van antilichaam-afhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC). Neutrofielen met anti-tumor activiteit kunnen worden geïsoleerd uit perifeer bloed van kankerpatiënten en tumordragende muizen. De neutrofielen worden genoemd tumor meegevoerde neutrofielen (TEN) het onderscheiden van neutrofielen van gezonde proefpersonen of naïeve muizen die geen significante tumor cytotoxische activiteit vertonen. Vergeleken met andere witte bloedcellen, neutrofielen tonen verschillende drijfvermogen waardoor het mogelijk is om een> 98% zuivere populatie neutrofielen te verkrijgen wanneer onderworpen aan een dichtheidsgradiënt. Maar naastde normale hoge dichtheid neutrofielen populatie (HDN) bij kankerpatiënten, in tumordragende muizen, evenals onder chronische ontstekingsaandoeningen, verschillende low-density neutrofielen populaties (LDN) zijn opgenomen in de circulatie. LDN co-zuivert met de mononucleaire fractie en kan worden gescheiden van mononucléaire cellen met behulp van positieve of negatieve selectie strategieën. Wanneer de zuiverheid van de geïsoleerde neutrofielen wordt bepaald door flow-cytometrie, kunnen ze worden toegepast voor in vitro pt in vivo functionele assays. We beschrijven technieken voor het bewaken van de antitumoractiviteit van neutrofielen, hun vermogen om te migreren en reactieve zuurstofsoorten te produceren, alsmede toezicht op hun fagocytische capaciteit ex vivo. We technieken beschrijven verder de neutrofielen in vivo traceeretiket en hun anti-metastatisch vermogen in vivo te bepalen. Al deze technieken zijn essentieel voor het begrip van het verkrijgen en karakteriseren neutrofielen met anti-tumorfunctie.

Introduction

Neutrofielen werden aanvankelijk gekarakteriseerd als het aangeboren immuunsysteem cellen die als eerste lijn verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Vandaag de dag is het bekend dat neutrofielen hebben verdergaande functies, betrokken zijn bij de montage van adaptieve immuunreacties tegen vreemde antigenen ^1,2, het reguleren van hematopoiese ^3, angiogenese ⁴ en wondgenezing ^5. Daarbij mag neutrofielen tumorgroei en metastatische progressie beïnvloeden door hun pro- en anti-tumor activiteiten ^6,7. Neutrofielen worden gekenmerkt door een polymorfe gesegmenteerde kern (vandaar aangeduid polymorfonucleaire (PMN) leukocyten) en ten minste drie verschillende subklassen van granules en secretorische blaasjes ⁸ (Figuur 1 A-C).

Neutrofielen hebben grote fagocytische capaciteit en hoge NADPH-oxidase activiteit essentieel is voor microbiële verwijdering en scheiden een groot aantal chemokinen belangrijk bijtraction extra neutrofielen en andere immuuncellen naar de plaats van ontsteking ^8,9. Neutrofielen worden gekenmerkt door de expressie van een groot aantal oppervlaktereceptoren zoals Toll-achtige receptoren (TLRs), C-type lectine receptoren (CLRS), complement receptor 3 (CD11b / CD18) en andere adhesiemoleculen (bijvoorbeeld, L-selectine, LFA-1, VLA-4 en carcinoembryonaal antigen gerelateerde celadhesie molecuul 3 (CEACAM3 / CD66b)), chemokine receptoren (bijvoorbeeld, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), chemoattractant receptoren (bv PAFR, LTB ₄ R en C5AR) , cytokine receptoren (bijvoorbeeld, G-CSFR, IL-1 R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptide receptoren (bv FPR1-3) en Fc-receptoren (bijvoorbeeld CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) en CD64 (FcyRI) ^10. Bij muizen worden gewoonlijk geïdentificeerd als neutrofielen CD11b ⁺ Ly6G ^+, terwijl menselijke neutrofielen worden geïdentificeerd met de CD 11, CD15, CD16 en CD66b leukocyten markers. Ook wordt algemeen aanvaard kleur wordt de granule-eiwitten myeloperoxidase (MPO) en neutrofiel elastase (NE) voor detectie van neutrofielen in weefsels.

Het blijft onduidelijk of de diverse functies van neutrofielen worden gemedieerd door dezelfde cel of door afzonderlijke cel subpopulaties. Accumuleren gegevens wijzen op de aanwezigheid van een heterogene populatie neutrofielen die een hoge mate van plasticiteit die door pro-inflammatoire stimuli en hun micro ^11,12 vertoont. Fridlender et al. ¹³ hebben schromelijk verdeelde de neutrofielen bij kanker in twee belangrijke subpopulaties genoemd N1 met anti-tumor eigenschappen en N2 met pro-tumor eigenschappen. Bij kanker, alsmede in chronische ontsteking, is er een extra subpopulatie uit granulocytic myeloide suppressor cellen (G-MDSCs) dat T-celresponsen ¹⁴ onderdrukken. G-MDSCs worden als onrijpe myeloïde cellen gekenmerkt door een CD11b ⁺ Ly6C zijn^lage Ly6G ^hi fenotype in muizen ^15, terwijl het hebben van een CD15 ⁺ / CD16 ^laag fenotype in de menselijke ^16. G-MDSCs uiten hogere niveaus van arginase en myeloperoxidase, terwijl lagere niveaus van cytokines en chemokines dan normaal circulerende neutrofielen. Ze zijn minder fagocytische en trekvogels, maar produceren hogere niveaus van ROS ^15,17,18. In dit document zullen we een aantal fundamentele methoden voor isolatie en karakterisering van neutrofielen met anti-tumor eigenschappen te beschrijven.

Terwijl neutrofielen vormen de grootste bevolking van alle witte bloedcellen in het menselijk omloop (45-70%; 1800 – 6000 / ul), bij muizen, onder normale omstandigheden, ze zijn nogal mager (10 – 15%; 300-500 / ul ). De neutrofielen stijgt gestaag op ontstekingen en soms met kanker, die een toestand van chronische ontsteking ⁷ vertegenwoordigt. Neutrofielen ontwikkelen van multipotent gemeenschappelijke myeloïde voorloper (CMP) cells in het beenmerg, door een differentiatieproces passeren van de fasen van myeloblasten (MB), promyelocyten (PM), myelocyten (MC), metamyelocyten (MM) en band cellen (BC) ^8. De volwassen, post-mitotische neutrofielen kan binnen het beenmerg blijven voor 4 – 7 dagen voordat ze worden vrijgegeven aan de circulatie ^8. Neutrofielen omzet in het bloed is gewoonlijk snel met een gemiddelde halfwaardetijd van 6-12 uur, eventueel verlengd onder ontstekingsaandoeningen. Gestimuleerde neutrofielen hebben anti-tumorigene activiteit, een functie die kan worden verworven door het blootstellen van de naïeve neutrofielen naar de chemokinen IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 en CXCL5 ^6,19 of kunstmatig beperkt door ze bloot te stellen aan de forbolester forbol 12 -myristate 13-acetaat (PMA) ^6.

De korte halfwaardetijd van bloed neutrofielen samen met het lage aantal neutrofielen (~ 3-5 x 10 ⁵⁾ bereikt van 1 ml bloed van een naïeve 6-8 weken oude muis, hebben het gemaaktmoeilijk om de functie van circulerende neutrofielen muis in vitro onderzoeken. Om deze moeilijkheid te overwinnen, zijn andere bronnen gebruikt. Zo kunnen grote aantallen neutrofielen worden verkregen uit het beenmerg ²⁰ of het peritoneum volgend op de inductie van steriele ontsteking (bijvoorbeeld na intraperitoneale injectie van thioglycolaat cultuurvloeistof of Zymosan A). Opgemerkt wordt dat neutrofielen verkregen uit de peritoneale holte geen anti-tumorontwikkeling (ongepubliceerde waarneming) uitoefenen.

. Granot et al opgemerkt dat ⁶ BALB / c muizen geïnoculeerd met orthotopically de muis 4T1 borstcarcinoom cellijn ontwikkelen neutrofilie die verergert tot tumorprogressie ⁶ (figuur 2A), zodat 20-40000000 bloedneutrofielen gemakkelijk worden geïsoleerd uit 1 ml bloed 3-4 weken na de tumor-inoculatie. Deze neutrofielen hebben anti-tumor activiteiten verworven, en hebben daarom COI geweestned-tumor meegevoerde neutrofielen (TEN), teneinde deze te onderscheiden van naïeve neutrofielen ⁶ (Figuur 2B). Terwijl high-density neutrofielen (HDN figuur 1A) sterk anti-tumorigene, low-density neutrofielen (LDN figuur 1B) gegenereerd in de context van kanker niet ^21. Ook, high-density neutrofielen uit het beenmerg en de milt van tumordragende muizen anti-tumor activiteit (ongepubliceerde gegevens). Opgemerkt wordt dat bij tumorprogressie de milt geleidelijk vergroot (splenomegalie), met toenemende hoeveelheden van neutrofielen.

Opgemerkt wordt dat de TEN ook geproduceerd in andere modellen van kanker waaronder zowel spontane (MMTV-PyMT en MMTV-Wnt1 mammaire tumoren en k-Ras driven longtumoren) en geïnjecteerd (AT-3 (MMTV-PyMT) en E0771 borstcarcinoom cellen, LLC Lewis longcarcinoom cellen en B16-F10 melanoomcellen). De mate van neutrofiel mobilisatie in deze tumof modellen veel minder dan van 4T1-geïnoculeerde muizen, tot 5-10 x 10 ⁶ neutrofielen in 1 ml bloed na 3 weken.

Protocol

Dieren: 5-7 weken oude BALB / c muizen werden gekocht bij Harlan (Israel). Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door de Hebreeuwse Universiteit van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). Human monsters: Verzamelen van bloed van kankerpatiënten en gezonde vrijwilligers werd goedgekeurd door Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB). 1. Inductie van neutrofielen met Anti-tumor Properties in vivo met behulp van een Breast Cancer Mouse Model. </…

Representative Results

In een recente studie van een anti-metastatische werking van neutrofielen 6 identificeerden we. Neutrofielen van tumordragende muizen verwerven van een cytotoxische fenotype en het vermogen om tumorcellen te doden 6. Dit in tegenstelling tot neutrofielen uit naïeve muizen die geen significante anti-tumor effect 6 hebben. Enkele van de in de sectie protocol beschreven technieken gebruikt voor het bestuderen van anti-tumor neutrofielfunctie in vitro en in vivo 6.</s…

Discussion

Neutrofielen zijn de meest voorkomende van witte bloedcellen en de eerste responders bij infecties en ontstekingen. Als zodanig zijn ze zeer gevoelig voor externe stimuli en zijn allemaal toegewezen. Bovendien neutrofielen een zeer korte halfwaardetijd en een hoge omloopsnelheid. Samen vormen deze elementen voeren een aantal problemen bij het werken met neutrofielen, zodat unieke experimentele strategieën nodig. Zo zijn er verschillende neutrofielen zuiveringsstrategieën, elk met zijn eigen voor- en nadelen.

<p cl…

Materials

CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells	ADCC	CRL-2539	Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate	Falcon	353047	Sterile
100 mm Tissue Culture Plate	Corning	430167	Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask	Nunc	156340	Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish	Miniplast, Ein Shemer, Israel	20090-01-017	Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835015-40-111	Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835050-21-111	Sterile
Falcon 12×75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube	Becton Dickinson	352058	Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm	Merck Millipore	PSMT010R1	Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate	Costar	3917	Sterile
Cell Strainer (40 mm)	BD Falcon	352340	Sterile
20G 1.5" Needle	BD Microlance 3	301300	Sterile
23G 1" Needle	BD Microlance 4	300800	Sterile
25Gx5/8" Needle	BD Microlance 5	300600	Sterile
0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	Sterile
9 mm Clips	BD, AutoClip	427631	Sterile
EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18000
MACS LS Separation Column	Miltenyi Biotech	130-042-201	Sterile
MidiMACS Separator Magnet	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Microscope Glass Slide	Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo	J1800AMNZ
Orbital Shaker	Sky line, ELMI	S-3.02.10L
Plate Reader	TECAN	InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Sigma	A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)	BD Pharmingen	550891	Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)	Molecular Probes	C1157
Dextran T500	Sigma	31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
Sodium azide (NaN3)	Sigma	S8032	Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Sigma	D5796	Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium	Life Technologies	31985062	Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758	Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated	Sigma	F9665	Sterile
L-Glutamine	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-020-1A	Sterile
Sodium pyruvate	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-042-1B	Sterile
Penicillin Streptomycin x1000 solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-031-5	Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-1	Sterile
PBSx10 without Ca2+ and Mg2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-5A	Sterile
HPLC grade water	J.T. Baker	4218-03	Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium	Life Technologies	A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS			Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO			Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution	Sigma	HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS			Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1119	Sigma	11191	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077	Sigma	10771	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5	Promega	E153A	Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution	Promega	E1501	Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution	Sigma	MHS-32
PBS+0.5% BSA			Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS+1% BSA			Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA			Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water                     and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3)			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl)			Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution			Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution			Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide			Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution			Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-046-1	Sterile
1 mg/ml Zymosan A			Resuspend 1 mg Zymosan A  in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube.                            Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave.            Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit	STEMCELL Technologies	18557
EasySep PE selection cocktail	STEMCELL Technologies	18151
the EasySep magnetic nanoparticles	STEMCELL Technologies	18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19257
FITC BrdU flow kit	BD Pharmingen	559619
MACS Neutrophil isolation kit	Miltenyi Biotec	130-097-658
Phagocytosis Assay Kit	Cayman Chemical Company	500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody	Biolegend	101302
Purified rat anti-Ly6G antibody	BD Pharmingen	551459	Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody	Biolegend	127608	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G	BD Pharmingen	551460	Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	65-1276	Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	75-1276	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b	BD Pharmingen	553310	Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1)	BD Pharmingen	553127	Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45	BD Pharmingen	553081	Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80	Abcam	ab60343	Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b	Biolegend	305103	Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)	BD Pharmingen	553927	Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody	BioLegend	100314	Clone 145-2C11