Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften

Summary

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Abstract

Neutrophile, die häufigste aller weißen Blutzellen im menschlichen Kreislauf, spielen eine wichtige Rolle bei der Verteidigung des Wirts gegen eindringende Mikroorganismen. Außerdem spielen die Neutrophilen eine zentrale Rolle bei der Immunüberwachung von Tumorzellen. Sie haben die Fähigkeit, Tumorzellen entweder durch eine Zelle kontaktabhängige Mechanismus mit Wasserstoffperoxid oder durch antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) zu erkennen und zu induzieren Tumorzelltod. Neutrophilen mit Antitumor-Aktivität können aus dem peripheren Blut von Krebspatienten und von Tumor-tragenden Mäusen isoliert werden. Diese Neutrophilen werden als tumor mitgerissen Neutrophilen (TEN), um sie von Neutrophilen von gesunden Probanden oder naiven Mäusen, die keine signifikante Tumor zytotoxische Aktivität zeigen, zu unterscheiden. Verglichen mit anderen weißen Blutzellen, Neutrophilen zeigen unterschiedliche Auftriebs macht es möglich, eine> 98% rein neutrophilen Population, wenn sie einer Dichtegradientenzentrifugation unterworfen erhalten. Jedoch zusätzlichzum normalen hoher Dichte neutrophilen Population (HDN), bei Krebspatienten, in Tumor-tragenden Mäusen, wie auch unter chronischen Entzündungsbedingungen, deutlich niedriger Dichte neutrophile Populationen (LDN) sind in den Kreislauf. LDN Co-Reinigung mit der einkernigen Fraktion und von mononukleären Zellen mit entweder positiven oder negativen Selektionsstrategien getrennt werden. Sobald die Reinheit der isolierten Neutrophile durch Durchflusszytometrie bestimmt sind, können sie für die in vitro und in vivo funktionelle Assays verwendet werden. Wir beschreiben Methoden zur Überwachung der anti-Tumor-Aktivität von Neutrophilen, ihre Fähigkeit zu wandern und reaktive Sauerstoffspezies zu erzeugen, sowie die Überwachung ihrer phagozytischen Kapazität ex vivo. Wir beschreiben weitere Techniken, um die Neutrophile in vivo-Tracking zu kennzeichnen und ihre anti-metastatischen Kapazität in vivo zu bestimmen. Alle diese Techniken sind für das Verständnis, wie man zu erhalten und zu charakterisieren Neutrophilen mit Anti-Tumor-Funktion.

Introduction

Neutrophile wurden zunächst als die angeborene Immunzellen, die als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen dienen gekennzeichnet. Heute ist bekannt, dass Neutrophile haben weiterreichende Funktionen, die in Montage adaptive Immunantwort gegen fremde Antigene ^1,2, Regulierung der Hämatopoese ^{3, 4} Angiogenese und Wundheilung ⁵ beteiligt. Zusätzlich kann Neutrophilen Tumorwachstum und Metastasen Progression beeinflussen aufgrund ihres pro- und anti-Tumor-Aktivitäten ^6,7. Neutrophile werden durch einen polymorphen segmentierten Kern gekennzeichnet (daher bezeichnet polymorphkernigen (PMN) Leukozyten) und enthalten mindestens drei verschiedene Unterklassen von Granulat sowie Sekretvesikel ⁸ (1A-C).

Neutrophile besitzen eine hohe phagozytische Kapazität und NADPH-Oxidase-Aktivität kritisch für Mikrobenentfernung und sezernieren eine Vielzahl von Chemokinen wichtig für zuminTraktions zusätzlicher Neutrophilen und anderen Immunzellen an den Ort der Entzündung ^8,9. Neutrophile werden durch die Expression einer großen Menge von Oberflächenrezeptoren einschließlich Toll-like Rezeptoren (TLR), dadurch gekennzeichnet, C-Typ-Lektin-Rezeptoren (CLRs), Komplement-Rezeptor 3 (CD11b / CD18) und anderen Adhäsionsmolekülen (zB L-Selectin, LFA-1, VLA-4 und carcinoembryonales Antigen bezogenen Zelladhäsionsmolekül 3 (CEACAM3 / CD66b)), Chemokinrezeptoren (beispielsweise CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2) Chemoattraktans-Rezeptoren (zB PAFR LTB ₄ R und C5aR) Zytokin-Rezeptoren (zB G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), Formyl-Peptid-Rezeptoren (zB FPR1-3) und Fc-Rezeptoren (zB CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) und CD64 (FcyRI) ^10. Bei Mäusen sind Neutrophile in der Regel als CD11b ⁺ Ly6G ⁺ identifiziert, wohingegen menschlichen Neutrophilen werden mit den CD11b, CD15, CD16 und CD66b Leukozyten-Marker identifiziert. Es ist auch allgemein akzeptiert, um die Granulat Proteine ​​Myeloperoxidase (MPO) und Neutrophilen-Elastase (NE) zum Nachweis von Neutrophilen im Gewebe zu färben.

Es ist noch unklar, ob die verschiedenen Funktionen der Neutrophilen von der gleichen Zelle oder mit verschiedenen Zellunterpopulationen vermittelt. Akkumulieren Daten deuten auf die Anwesenheit eines heterogenen Neutrophilen-Population, die ein hohes Maß an Plastizität durch proinflammatorische Stimuli und der Mikroumgebung ^11,12 betroffen aufweist. Fridlender et al. ¹³ haben grob unterteilt die Neutrophilen in Krebs in zwei große Teilpopulationen genannt N1 mit Anti-Tumor-Eigenschaften und N2 mit pro-Tumor-Eigenschaften. Bei Krebs, wie auch bei chronischen Entzündungen, gibt es einen zusätzlichen Subpopulation granulocytic myeloische-Suppressorzellen (G-MDSC), die T-Zellreaktionen zu unterdrücken ¹⁴ zusammengesetzt ist. G-MDSCs gelten als unreifen myeloischen Zellen, gekennzeichnet durch eine CD11b ⁺ Ly6C sein^Nieder Ly6G ^hallo Phänotyp bei Mäusen ^15, während mit einem CD15 ⁺ / CD16 ^niedrig Phänotyp in humanen ^16. G-MDSCs auszudrücken höhere Arginase und Myeloperoxidase, während niedrigere Zytokine und Chemokine als normal zirkulierenden Neutrophilen. Sie sind weniger phagozytischen und Zugvögel, aber produzieren höheren ROS ^15,17,18. In der vorliegenden Arbeit werden wir einige grundlegende Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften zu beschreiben.

Während Neutrophile bilden die größte Bevölkerung aller weißen Blutkörperchen im menschlichen Kreislauf (45 – 70%; 1800 – 6000 / ul), bei Mäusen, unter normalen Bedingungen, sie sind eher spärlich (10-15%; 300-500 / ul ). Die Erhöhungen Neutrophilenzahl fest auf Entzündung und gelegentlich bei Krebs, die eine chronische Entzündung ⁷ stellt. Neutrophile entwickeln sich aus multipotenten myeloischen Vorläufer gemeinsamen (CMP) cells im Knochenmark, durch einen Differenzierungsprozess vorbei an den Stufen der Myeloblasten (MB), Promyelozyten (PM), Myelozyten (MC), Metamyelozyten (MM) und Bandzellen (BC) ^8. Die reifen, post-mitotischen Neutrophile innerhalb des Knochenmarks für 4 bleiben – 7 Tage, bevor sie in den Kreislauf ⁸ freigegeben. Neutrophilen-Umsatz im Blut ist in der Regel eine schnelle mit einer mittleren Halbwertszeit von 6 bis 12 Stunden, die unter entzündlichen Bedingungen verlängert werden kann. Nicht-stimulierten Neutrophilen haben anti-tumorigene Aktivität, eine Funktion, die durch Aussetzen der naiven Neutrophilen an der Chemokine IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 und CXCL5 ^6,19 oder künstlich erworben werden können, indem sie an den Phorbolester Phorbol 12 begrenzt -myristat-13-acetat (PMA) ^6.

Die kurze Halbwertszeit von Blut Neutrophilen zusammen mit der geringen Zahl der neutrophilen Granulozyten (~ 3-5 x 10 ⁵⁾ von 1 ml Blut eines naiven 6 erreicht – 8 Wochen alten Maus, haben es geschafftschwierig, die Funktion der zirkulierenden Neutrophilen Maus in vitro zu erforschen. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, sind andere Quellen verwendet. Zum Beispiel kann eine große Anzahl von Neutrophilen aus dem Knochenmark ²⁰ oder das Peritoneum nach der Induktion der Entzündung steril erhalten werden (beispielsweise nach intraperitonealer Injektion von Thioglykolat-Bouillon oder Zymosan A). Es sei darauf hingewiesen, daß Neutrophile von der Peritonealhöhle erhalten keine anti-tumorigene Aktivität (unveröffentlichte Beobachtung) auszuüben.

. Granot et al ⁶ beobachtet, dass BALB / c Mäusen orthotop mit der Maus 4T1-Brustkarzinom-Zelllinie beimpft entwickeln Neutrophilie der mit Tumorprogression ⁶ (2A) verschärft, so dass 20-40000000 Blutneutrophilen leicht von 1 ml Blut isoliert werden 3-4 Wochen nach der Tumor-Inokulation. Diese Neutrophilen haben Anti-Tumor-Aktivitäten erworben und wurden entsprechend coi gewesenNed tumor mitgerissen Neutrophilen (TEN), um sie einem naiven Neutrophilen ⁶ (2B) unterscheiden. Während hoher Dichte Neutrophilen (HDN, 1A) sind hoch anti-tumorigenen niedriger Dichte Neutrophilen (LDN, 1B) im Rahmen von Krebs erzeugt nicht ^21. Auch hoher Dichte Neutrophile aus dem Knochenmark und der Milz von Tumor-tragenden Mäusen anti-Tumor-Aktivität (unveröffentlichte Daten). Es sollte beachtet werden, dass bei der Tumorprogression die Milz allmählich vergrößert (Splenomegalie) mit steigenden Mengen an Neutrophilen.

Es sollte beachtet werden, dass TEN werden auch in anderen Modellen von Krebs, einschließlich sowohl spontane (MMTV-PyMT und MMTV-Wnt1 Brusttumoren und K-ras angetrieben Lungentumoren) erzeugt und injiziert (AT-3 (MMTV-PyMT) und E0771 Mammakarzinom werden Zellen, LLC Lewis-Lungenkarzinom-Zellen und B16-F10-Melanomzellen). Allerdings ist der Umfang der Neutrophilen-Mobilisierung in diese tumoder Modelle ist weit weniger als der 4T1-inokulierten Mäusen erreichte 5-10 x 10 ⁶ Neutrophile in 1 ml Blut nach 3 Wochen.

Protocol

Tiere: 5-7 Wochen alte BALB / c-Mäuse werden von Harlan (Israel) bezogen. Alle Experimente mit Tieren wurden von der Hebräischen Universität Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen. Humanproben: Sammlung von Blut von Krebspatienten und gesunden Probanden wurde von Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB) genehmigt. 1. Induktion von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften in vivo Verwendung eines Brustkrebs-Mausmodell. <p class="jov…

Representative Results

In einer neueren Studie identifizierten wir eine antimetastatische Funktion für Neutrophile 6. Neutrophile von tumortragenden Mäusen erwerben einen zytotoxischen Phänotyp und haben die Fähigkeit, Tumorzellen 6 töten. Dies steht im Gegensatz zu Neutrophilen von naiven Mäusen, die keinen signifikanten Antitumoreffekt 6 haben. Einige der in dem Protokoll Abschnitt beschriebenen Techniken zur Untersuchung Antitumor Neutrophilenfunktion in vitro und in vivo-6</em…

Discussion

Neutrophile sind die häufigsten aller weißen Blutzellen und die Ersthelfer bei Infektionen und Entzündungen. Als solche sind sie sehr empfindlich für externe Signale sind und leicht aktiviert. Darüber hinaus haben Neutrophilen eine sehr kurze Halbwertszeit und einen schnellen Umsatz. Zusammen bilden diese Merkmale heben einige Schwierigkeiten in der Arbeit mit Neutrophilen, so dass einzigartige experimentelle Strategien erforderlich sind. Beispielsweise gibt es mehrere Neutrophilen Reinigungsstrategien, die jeweils…

Materials

CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells	ADCC	CRL-2539	Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate	Falcon	353047	Sterile
100 mm Tissue Culture Plate	Corning	430167	Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask	Nunc	156340	Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish	Miniplast, Ein Shemer, Israel	20090-01-017	Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835015-40-111	Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835050-21-111	Sterile
Falcon 12×75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube	Becton Dickinson	352058	Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm	Merck Millipore	PSMT010R1	Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate	Costar	3917	Sterile
Cell Strainer (40 mm)	BD Falcon	352340	Sterile
20G 1.5" Needle	BD Microlance 3	301300	Sterile
23G 1" Needle	BD Microlance 4	300800	Sterile
25Gx5/8" Needle	BD Microlance 5	300600	Sterile
0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	Sterile
9 mm Clips	BD, AutoClip	427631	Sterile
EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18000
MACS LS Separation Column	Miltenyi Biotech	130-042-201	Sterile
MidiMACS Separator Magnet	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Microscope Glass Slide	Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo	J1800AMNZ
Orbital Shaker	Sky line, ELMI	S-3.02.10L
Plate Reader	TECAN	InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Sigma	A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)	BD Pharmingen	550891	Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)	Molecular Probes	C1157
Dextran T500	Sigma	31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
Sodium azide (NaN3)	Sigma	S8032	Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Sigma	D5796	Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium	Life Technologies	31985062	Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758	Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated	Sigma	F9665	Sterile
L-Glutamine	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-020-1A	Sterile
Sodium pyruvate	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-042-1B	Sterile
Penicillin Streptomycin x1000 solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-031-5	Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-1	Sterile
PBSx10 without Ca2+ and Mg2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-5A	Sterile
HPLC grade water	J.T. Baker	4218-03	Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium	Life Technologies	A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS			Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO			Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution	Sigma	HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS			Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1119	Sigma	11191	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077	Sigma	10771	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5	Promega	E153A	Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution	Promega	E1501	Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution	Sigma	MHS-32
PBS+0.5% BSA			Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS+1% BSA			Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA			Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water                     and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3)			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl)			Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution			Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution			Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide			Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution			Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-046-1	Sterile
1 mg/ml Zymosan A			Resuspend 1 mg Zymosan A  in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube.                            Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave.            Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit	STEMCELL Technologies	18557
EasySep PE selection cocktail	STEMCELL Technologies	18151
the EasySep magnetic nanoparticles	STEMCELL Technologies	18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19257
FITC BrdU flow kit	BD Pharmingen	559619
MACS Neutrophil isolation kit	Miltenyi Biotec	130-097-658
Phagocytosis Assay Kit	Cayman Chemical Company	500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody	Biolegend	101302
Purified rat anti-Ly6G antibody	BD Pharmingen	551459	Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody	Biolegend	127608	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G	BD Pharmingen	551460	Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	65-1276	Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	75-1276	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b	BD Pharmingen	553310	Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1)	BD Pharmingen	553127	Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45	BD Pharmingen	553081	Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80	Abcam	ab60343	Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b	Biolegend	305103	Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)	BD Pharmingen	553927	Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody	BioLegend	100314	Clone 145-2C11