Выделение и характеристика нейтрофилов с Противоопухолевые свойства
Summary
Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.
Abstract
Нейтрофилы, наиболее распространенным из всех белых кровяных клеток в кровотоке человека, играют важную роль в защите хозяина против вторжения микроорганизмов. Кроме того, нейтрофилы играют центральную роль в иммунной наблюдения опухолевых клеток. Они обладают способностью распознавать опухолевые клетки и индуцировать гибель клеток опухоли или через контакт-зависимого механизма клеток с участием перекиси водорода или через антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Нейтрофилы с противоопухолевой активностью, могут быть выделены из периферической крови больных раком и опухоли мышей. Эти нейтрофилы называются опухолевых захваченных нейтрофилов (ДЕСЯТЬ), чтобы отличить их от нейтрофилов здоровых субъектов или наивного мышей, которые не показывают никакого существенного опухоли цитотоксическую активность. По сравнению с другими лейкоцитов, нейтрофилов показывают другую плавучесть делает возможным получение> 98% населения чистый нейтрофилов при воздействии на градиенте плотности. Однако, в дополнениек нормальной высокой плотности нейтрофилов населения (ГДН), у больных раком, в опухоли мышей, а также при хронических воспалительных состояний, отдельные популяции низкой плотности нейтрофилов (LDN) появляются в обращении. LDN совместно очищают с мононуклеарных фракции и может быть отделена от мононуклеарных клеток, используя положительный или отрицательный алгоритмов выбора. После того, как чистота выделенных нейтрофилов определяется с помощью проточной цитометрии, они могут быть использованы для ин витро и ин виво функциональных анализов. Мы опишем методы для мониторинга противоопухолевую активность нейтрофилов, их способность мигрировать и продуцировать активные формы кислорода, а также мониторинг их фагоцитарную способность экс VIVO. Мы также описать методы, чтобы пометить нейтрофилов для отслеживания в естественных условиях, и определить их антиметастатическую потенциала в естественных условиях. Все эти методы имеют важное значение для понимания того, как получить и охарактеризовать нейтрофилов с анти-опухолифункция.
Introduction
Нейтрофилы вначале были охарактеризованы как врожденных иммунных клеток, которые служат в качестве первого линия обороны против вторжения микроорганизмов. Сегодня известно, что нейтрофилы имеют более далеко идущие функции, будучи вовлеченным в монтаже адаптивного иммунного ответа против чужеродных антигенов 1,2, регулирующих кроветворение 3, 4 и ангиогенез ранозаживляющее 5. Кроме того, нейтрофилы могут повлиять на рост опухоли и метастазов прогрессирование в силу своих сторонников и противоопухолевых деятельности 6,7. Нейтрофилы характеризуются полиморфной сегментированные ядра (следовательно, называют полиморфно (PMN лейкоцитов)) и содержат по крайней мере три различных подклассов гранул, а также секреторные везикулы 8 (1А-C).
Нейтрофилы обладают высокой фагоцитарной способности и высокой активности НАДФН-оксидазы критической для устранения микробной и секретируют широкий спектр важных хемокинов, по крайнейтяги дополнительных нейтрофилов и других иммунных клеток к месту воспаления 8,9. Нейтрофилы характеризуются экспрессии большого количества поверхностных рецепторов, включая Toll-подобных рецепторов (TLR,), С-типа рецепторов лектинов (Clrs), дополняют рецептор 3 (CD11b / CD18) и другие адгезивные молекулы (например, L-селектина, LFA-1, VLA-4 и карциноэмбриональный антиген-связанных молекулы клеточной адгезии 3 (CEACAM3 / CD66b)), рецепторы хемокинов (например, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), хемоаттрактант рецепторы (например, PAFR, LTB 4 R и C5aR) , рецепторов цитокинов (например, G-ЧСФР, ИЛ-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, ФНО), формил-пептид рецепторов (например, FPR1-3), и Fc рецепторы (например, CD16 (FcγRIII ), CD32 (FcγRII) и CD64 (FcγRI) 10. У мышей, нейтрофилов, как правило, определены как CD11b + Ly6G +, тогда как нейтрофилы человека, идентифицируют с использованием лейкоцитов маркеры CD11b, CD15, CD16 и CD66b, Также общепринятым для окрашивания для миелопероксидазы белков гранул (МРО) и эластазы нейтрофилов (NE) для обнаружения нейтрофилов в тканях.
Он по-прежнему неясно, будет ли разнообразные функции нейтрофилов при посредничестве той же клетке или отдельных клеток субпопуляций. Накопление данные позволяют предположить, на наличие гетерогенной популяции нейтрофилов, который проявляет высокую степень пластичности, пострадавших от провоспалительных стимулов и микросреды 11,12. Фридлендер и др. 13 грубо разделить нейтрофилов в рак в двух основных групп населения называют N1 с противоопухолевыми свойствами и N2 со свойствами про-опухолей. При раке, а также при хроническом воспалении, имеется дополнительный субпопуляция состоит из гранулоцитарного миелоидных полученных клеток-супрессоров (G-MDSCs), которые подавляют Т-клеточные ответы 14. G-MDSCs считаются незрелые миелоидные клетки характеризуются CD11b + Ly6Cнизкий Ly6G привет фенотип у мышей 15, имея CD15 + CD16 / низкий фенотип человека 16. Г-MDSCs выразить более высокие уровни аргиназой и миелопероксидазы, а более низкие уровни цитокинов и хемокинов, чем нормальных циркулирующих нейтрофилов. Они меньше фагоцитарной и миграционной, но дают более высокие уровни АФК 15,17,18. В настоящей работе мы опишем некоторые основные методики выделения и характеристики нейтрофилов с противоопухолевыми свойствами.
В то время как нейтрофилы составляют самое многочисленное население всех белых кровяных клеток в кровотоке человека (45 – 70%; 1800 – 6000 / мкл), у мышей, при нормальных условиях, они довольно редкие (10 – 15%; 300 – 500 / мкл ). Число нейтрофилов увеличивается неуклонно Upon воспаления, а иногда и в рак, который представляет собой состояние хронического воспаления 7. Нейтрофилы развиваются из общего миелоидного мультипотентны предшественника (CMP) CEзаполняет в костном мозге, с помощью процесса, дифференциации, проходящие этапы миелобласты (МБ), промиелоциты (ТЧ), миелоциты (MC), метамиелоцитов (мм) и диапазона ячеек (BC) 8. Зрелые, постмитотические нейтрофилы могут оставаться в костном мозге в течение 4 – 7 дней, прежде чем они будут освобождены в обращении 8. Оборот нейтрофилов в крови, как правило, быстрое со средним периодом полураспада 6 – 12 часов, который может быть продлен при воспалительных процессах. Нестимулированные нейтрофилы имеют ограниченный анти-онкогенного активности, особенность, которая может быть приобретена подвергая наивные нейтрофилов к хемокинов IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 и CXCL5 6,19 или искусственно, подвергая их к форбол эфира форбол 12 -myristate 13-ацетата (РМА) 6.
Короткий период полувыведения из крови нейтрофилов вместе с низким числом нейтрофилов (~ 3 – 5 х 10 5) достигается с 1 мл крови наивного 6 – 8 недель старой мыши, сделали этотрудно исследовать функцию циркулирующих нейтрофилов мыши в пробирке. Чтобы преодолеть эту трудность, другие источники были использованы. Например, большое число нейтрофилов, могут быть получены из костного мозга 20 или брюшины после индукции стерильного воспаления (например, после внутрибрюшинного введения тиогликолевой бульон или Зимозан А). Следует отметить, что нейтрофилы, полученные из брюшной полости не оказывает какого-либо анти-онкогенного активностью (неопубликованное наблюдение).
. Granot др 6 отмечено, что линии BALB / C мышей, инокулированных ортотопически с помощью мыши 4T1 молочной клеточной линии карциномы разработки нейтрофилию что усугубляет прогрессированию опухоли 6 (Фигура 2А), так что 20 – 40 миллионов нейтрофилов крови можно легко выделить из 1 мл крови 3 – 4 недели после прививки опухоли. Эти нейтрофилы приобрели противоопухолевой активностью, и, соответственно, был ИСПNED опухолевые захваченных нейтрофилы (ДЕСЯТЬ), для того, чтобы отличить их от наивных нейтрофилов 6 (рис 2b). В то время как нейтрофилы высокой плотности (СЗР, 1А) обладают высокой анти-онкогенными, нейтрофилы низкой плотности (LDN, рис 1б), генерируемые в контексте рака не 21. Кроме того, высокой плотности нейтрофилы из костного мозга и селезенки мышей с опухолями имеют противоопухолевую активность (неопубликованные данные). Следует отметить, что прогрессированию опухоли селезенки становится постепенно увеличена (спленомегалия), с увеличением количества нейтрофилов.
Следует отметить, что десять также генерируются в других моделях рака, включая как спонтанных (MMTV-PyMT и MMTV-Wnt1 опухолей молочной железы и K-Ras приводом опухолей легких) и вводили (АТ-3 (MMTV-PyMT) и E0771 карциномы молочной железы клетки, ООО карциномы легкого Льюиса клетки и В16-F10, клетки меланомы). Тем не менее, степень мобилизации нейтрофилов в этих свою очередьили модели гораздо меньше, чем от 4T1-инокулированных мышей, достигая 5 – 10 х 10 6 нейтрофилы в 1 мл крови через 3 недели.
Protocol
Representative Results
Discussion
Нейтрофилы являются наиболее распространенными из всех белых кровяных клеток и первыми отвечают в случаях инфекции и воспаления. Как таковые, они очень чувствительны к внешним сигналам и легко активированы. Кроме того, нейтрофилы имеют очень короткий период полураспада и быстрый обо?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
З. поддерживается грантами от I-CORE программу Израиля научного фонда (грант № 41/11), Abisch-Френкеля Фонд Rosetrees Доверие, Фонд исследований рака Израиль (ICRF – Исследование Карьера премии развития) и КОНЦЕРН фундамент. ZGF поддерживается грантами от Cancer Research Foundation Израиля (ICRF – Исследование Карьера Award развития), главный научный сотрудник Израильского Министерства здравоохранения и Израильской ассоциации легких.
Materials
| CELL LINES | |||
| Mouse 4T1 breast carcinoma cells | ADCC | CRL-2539 | Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS |
| PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS | |||
| 24-well Tissue Culture Plate | Falcon | 353047 | Sterile |
| 100 mm Tissue Culture Plate | Corning | 430167 | Sterile |
| 25 cm2 Tissue Culture Flask | Nunc | 156340 | Sterile |
| 90 mm Bacterial Grade Culture Dish | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 20090-01-017 | Sterile |
| 15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 835015-40-111 | Sterile |
| 50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube | Miniplast, Ein Shemer, Israel | 835050-21-111 | Sterile |
| Falcon 12×75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube | Becton Dickinson | 352058 | Sterile |
| Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm | Merck Millipore | PSMT010R1 | Sterile |
| White 96-Flat-Bottom Well Plate | Costar | 3917 | Sterile |
| Cell Strainer (40 mm) | BD Falcon | 352340 | Sterile |
| 20G 1.5" Needle | BD Microlance 3 | 301300 | Sterile |
| 23G 1" Needle | BD Microlance 4 | 300800 | Sterile |
| 25Gx5/8" Needle | BD Microlance 5 | 300600 | Sterile |
| 0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle | BD Micro-Fine Plus Demi | 320829 | Sterile |
| 9 mm Clips | BD, AutoClip | 427631 | Sterile |
| EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| MACS LS Separation Column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | Sterile |
| MidiMACS Separator Magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Microscope Glass Slide | Menzel-Gläser Superfrost Plus Thermo | J1800AMNZ | |
| Orbital Shaker | Sky line, ELMI | S-3.02.10L | |
| Plate Reader | TECAN | InfiniteF200Pro | |
| POWDER | |||
| Bovine serum albumin (BSA), fraction V | Sigma | A7906 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) | BD Pharmingen | 550891 | Sterile |
| CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) | Molecular Probes | C1157 | |
| Dextran T500 | Sigma | 31392 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma | S8032 | Highly toxic, handle with care |
| Thioglycollate powder | Difco | 225650 | |
| Zymosan A | Sigma | Z4250 | |
| MEDIA AND SUPPLEMENTS | |||
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Sigma | D5796 | Sterile |
| Opti-MEM® I reduced serum medium | Life Technologies | 31985062 | Sterile |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium | Sigma | R8758 | Sterile |
| Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated | Sigma | F9665 | Sterile |
| L-Glutamine | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-020-1A | Sterile |
| Sodium pyruvate | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-042-1B | Sterile |
| Penicillin Streptomycin x1000 solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-031-5 | Sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+ | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-023-1 | Sterile |
| PBSx10 without Ca2+ and Mg2+ | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-023-5A | Sterile |
| HPLC grade water | J.T. Baker | 4218-03 | Autoclave |
| SOLUTIONS | |||
| ACK – Ammonium-Chloride-Potassium | Life Technologies | A10492-01 | |
| Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS | Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter. | ||
| CFSE, 5 mM in DMSO | Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC. | ||
| Eosin Y solution | Sigma | HT110-2-32 | |
| Hanks' balanced salt solution | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 02-016-1A | Sterile |
| Heparin, 20 mg/ml in PBS | Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| Histopaque-1119 | Sigma | 11191 | Sterile filter through a 0.2 mm filter. |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | Sterile filter through a 0.2 mm filter. |
| Luciferase cell culture lysis buffer x5 | Promega | E153A | Dilute 1:5 in sterile water just before use. |
| Luciferase assay solution | Promega | E1501 | Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A) |
| Mayer's Hematoxylin solution | Sigma | MHS-32 | |
| PBS+0.5% BSA | Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| PBS+1% BSA | Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| 5x PBS with 2.5% BSA | Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA | Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) | Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter. | ||
| Saline (0.9% NaCl) | Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
| 0.2% NaCl solution | Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
| 1.6% NaCl solution | Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave | ||
| 2 % Sodium azide | Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic. | ||
| 3% Thioglycollate solution | Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw. Boil until solution becomes yellow and autoclave. | ||
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution. |
| Trypsin solution B | Biological Industries, Beth HaEmek, Israel | 03-046-1 | Sterile |
| 1 mg/ml Zymosan A | Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use. | ||
| KITS | |||
| EasySep PE selection kit | STEMCELL Technologies | 18557 | |
| EasySep PE selection cocktail | STEMCELL Technologies | 18151 | |
| the EasySep magnetic nanoparticles | STEMCELL Technologies | 18150 | |
| Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-332 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19762 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies | 19257 | |
| FITC BrdU flow kit | BD Pharmingen | 559619 | |
| MACS Neutrophil isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-097-658 | |
| Phagocytosis Assay Kit | Cayman Chemical Company | 500290 | |
| ANTIBODIES | |||
| FcR blocking antibody | Biolegend | 101302 | |
| Purified rat anti-Ly6G antibody | BD Pharmingen | 551459 | Clone 1A8 |
| PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody | Biolegend | 127608 | Clone 1A8 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G | BD Pharmingen | 551460 | Clone 1A8 |
| PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 65-1276 | Clone 1A8 |
| violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G | TONBO Biosciences | 75-1276 | Clone 1A8 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b | BD Pharmingen | 553310 | Clone M1/70 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) | BD Pharmingen | 553127 | Clone RB6-8C5 |
| PE-conjugated rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 553081 | Clone 30-F11 |
| FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80 | Abcam | ab60343 | Clone BM8 |
| FITC-conjugated mouse anti-human CD66b | Biolegend | 305103 | Clone G10F5 |
| Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k) | BD Pharmingen | 553927 | Clone R35-95 |
| LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11 |
Referências
- Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
- Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
- Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613 (2014).
- Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
- Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. , (2014).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
- Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
- Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
- Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524 (2012).
- Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: ‘N1’ versus ‘N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
- Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
- Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
- Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
- Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
- Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
- Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
- Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. , (2015).
