Isolering og karakterisering af neutrofiler med antitumoregenskaber

Summary

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Abstract

Neutrofiler, den mest rigelige af alle hvide blodlegemer i den humane cirkulation, spiller en vigtig rolle i værtens forsvar mod invaderende mikroorganismer. Desuden neutrofiler spiller en central rolle i immunovervågning af tumorceller. De har evnen til at genkende tumorceller og inducere tumor celledød enten gennem en celle kontakt-afhængig mekanisme, der involverer hydrogenperoxid eller via antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet (ADCC). Neutrofiler med antitumoraktivitet kan isoleres fra perifert blod fra cancerpatienter og tumorbærende mus. Benævnes disse neutrofiler tumor-indblandet neutrofiler (TEN) for at skelne dem fra neutrofiler af raske personer eller naive mus, der viser ingen signifikant tumor cytotoksisk aktivitet. Sammenlignet med andre hvide blodlegemer, neutrofiler vise forskellige opdrift, hvilket gør det muligt at opnå en> 98% rent neutrofil befolkning, når de underkastes en densitetsgradient. Men ud overtil den normale høj massefylde neutrofil population (HDN), hos cancerpatienter, i tumorbærende mus, samt under kroniske inflammatoriske tilstande, distinkte lav densitet neutrofile populationer (LDN) fremgår kredsløbet. LDN co-oprenses med fraktionen mononukleare og kan adskilles fra mononukleære celler ved anvendelse af enten positiv eller negativ udvælgelse strategier. Når renheden af de isolerede neutrofiler bestemmes ved flowcytometri, kan de anvendes til in vitro og in vivo funktionelle assays. Vi beskriver teknikker til overvågning af anti-tumor aktiviteten af neutrofiler, deres evne til at migrere og til at producere reaktive oxygenarter, såvel som overvågning af deres fagocytiske kapacitet ex vivo. Vi beskriver yderligere teknikker til at mærke de neutrofile til in vivo sporing, og til at bestemme deres anti-metastatiske kapacitet in vivo. Alle disse teknikker er afgørende for at forstå, hvordan du anskaffer og karakterisere neutrofiler med anti-tumorfunktion.

Introduction

Neutrofiler blev indledningsvist karakteriseret som medfødte immunceller, der tjener som første linje forsvar mod invaderende mikroorganismer. I dag er det kendt, at neutrofiler har mere vidtrækkende funktioner, være involveret i montering adaptive immunrespons mod fremmede antigener ^1,2, regulering hematopoiese ^3, angiogenese ⁴ og sårheling ^5. Derudover kan neutrofiler påvirke tumorvækst og metastatisk progression i kraft af deres pro- og anti-tumor aktiviteter ^6,7. Neutrofiler er karakteriseret ved en polymorf segmenteret kerne (betegnet dermed polymorfonukleære (PMN) leukocytter) og indeholder mindst tre forskellige underklasser af granulater samt sekretoriske vesikler ⁸ (figur 1A-C).

Neutrofiler besidder høj fagocytisk kapacitet og høj NADPH-oxidase-aktivitet kritisk for mikrobiel elimination, og udskiller en bred vifte af chemokiner vigtige itrækkraft yderligere neutrofiler og andre immunceller til stedet for inflammation ^8,9. Neutrofiler er karakteriseret ved ekspression af en stor mængde af overfladereceptorer herunder Toll-lignende receptorer (TLRs), C-type lectin Receptorer (CLR'er), komplement receptor 3 (CD11b / CD18) og andre adhæsionsmolekyler (fx L-selectin, LFA-1, VLA-4 og carcinoembryonisk antigen-relateret celleadhæsionsmolekyle 3 (CEACAM3 / CD66b)), kemokinreceptorer (f.eks CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), kemotiltrækkende receptorer (f.eks PAFR, _LTB4 R og C5aR) , cytokin-receptorer (f.eks G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptid-receptorer (f.eks FPR1-3), og Fc-receptorer (f.eks CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) og CD64 (FcyRI) ^10. Hos mus er neutrofiler normalt identificeret som CD11b ⁺ Ly6G ^+, mens humane neutrofiler identificeres ved hjælp af CD11b, CD15, CD16 og CD66b leukocyt markører. Det er også generelt accepteret at farvning for granulatet proteiner myeloperoxidase (MPO) og neutrofil elastase (NE) til påvisning af neutrofiler i væv.

Det er stadig uklart, om de forskellige funktioner af neutrofiler medieres af den samme celle eller ved distinkte celle subpopulationer. Akkumulerende data tyder for tilstedeværelsen af en heterogen neutrofil population, som udviser en høj grad af plasticitet påvirket af proinflammatoriske stimuli og mikromiljøet ^11,12. Fridlender et al. ¹³ har groft opdelt neutrofiler i kræft i to store delpopulationer betegnes N1 med anti-tumor egenskaber og N2 med pro-tumor egenskaber. I kræft, såvel som i kronisk inflammation, der er en ekstra sub-population bestående af granulocytiske myeloide-afledte suppressorceller (G-MDSCs), der undertrykker T-cellereaktioner ^14. G-MDSCs anses for at være umodne myeloide celler er karakteriseret ved en CD11 ⁺ Ly6C^lav Ly6G ^hi fænotype i mus ^15, og samtidig have en CD15 ⁺ / CD16 ^lav fænotype i humane ^16. G-MDSCs ekspres højere niveauer af arginase og myeloperoxidase, medens lavere niveauer af cytokiner og chemokiner end normale cirkulerende neutrofiler. De er mindre fagocyterende og vandrende, men producerer højere niveauer af ROS ^15,17,18. I det foreliggende dokument vil vi beskrive nogle grundlæggende metoder til isolering og karakterisering af neutrofiler med anti-tumor egenskaber.

Mens neutrofiler udgør den største bestand af alle hvide blodlegemer i menneskets omløb (45-70%, 1.800 – 6.000 / ul), i mus, under normale forhold, de er temmelig sparsomme (10 – 15%; 300-500 / ul ). Neutrofiltallet stiger støt upon inflammation og lejlighedsvis i kræft, hvilket er en tilstand af kronisk inflammation ^7. Neutrofiler udvikle sig fra multipotente fælles myeloid forløber (CMP) ceLLS i knoglemarven, gennem en differentiering proces passerer faser af Myeloblaster (MB), promyelocytter (PM), myelocytter (MC), metamyelocytes (MM) og band-celler (BC) ^8. De modne, post-mitotiske neutrofiler kan forblive inden knoglemarven til 4 – 7 dage før de frigives til kredsløbet ^8. Neutrofil omsætning i blodet er normalt hurtig med en gennemsnitlig halveringstid på 6-12 timer, hvilket kan forlænges under inflammatoriske tilstande. Stimulerede neutrofiler har begrænset anti-tumorigen aktivitet, en funktion, der kan erhverves ved at udsætte naive neutrofiler til chemokinerne IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 og CXCL5 ^6,19 eller kunstigt, ved at udsætte dem for phorbolesteren phorbol-12 -myristate 13-acetat (PMA) ^6.

Den korte halveringstid af blodneutrofiler sammen med det lave antal neutrofiler (~ 3-5 x 10 ⁵⁾ opnået fra 1 ml blod fra en naiv 6 – 8 uger gamle mus, har gjort detvanskeligt at udforske funktionen af cirkulerende muse neutrofil in vitro. At overvinde denne vanskelighed, er blevet anvendt andre kilder. For eksempel kan et stort antal neutrofiler opnås fra knoglemarven ²⁰ eller peritoneum efter induktionen af steril inflammation (fx efter intraperitoneal injektion af thioglycollat ​​bouillon eller Zymosan A). Det skal bemærkes, at neutrofiler opnået fra bughulen ikke udøve nogen anti-tumorigen aktivitet (upubliceret observation).

. Granot et al ⁶ observeret, at BALB / c-mus inokuleret orthotopisk med musen 4T1 brystcarcinoma-cellelinie udvikle neutrofili hvilket forværrer med tumorprogression ⁶ (figur 2A), således at 20 til 40.000.000 blodneutrofiler let kan isoleres fra 1 ml blod 3 – 4 uger efter tumorpodning. Disse neutrofiler har erhvervet anti-tumor aktiviteter og har derfor været COIdefinerede tumor-indblandet neutrofiler (TEN), for at skelne dem fra naive neutrofiler ⁶ (figur 2B). Mens høj tæthed neutrofiler (HDN, figur 1A) er yderst anti-tumorigen, low-density neutrofiler (LDN, figur 1B), der genereres i forbindelse med cancer, er ikke ^21. Også, high-density neutrofiler fra knoglemarven og milten af ​​tumorbærende mus har anti-tumor aktivitet (upublicerede data). Det skal bemærkes, at med tumorudvikling milten bliver gradvist forstørret (splenomegali), med stigende mængder af neutrofiler.

Det skal bemærkes, at TEN også genereres i andre modeller af cancer, herunder både spontane (MMTV-PyMT og MMTV-Wnt1 brysttumorer og K-Ras drevne lungetumorer) og injiceret (AT-3 (MMTV-PyMT) og E0771 brystcarcinom celler, LLC Lewis lungecarcinomceller og B16-F10 melanomceller). Imidlertid er omfanget af neutrofil tilvejebringelse i disse tumeller modeller er langt mindre end af 4T1-inokulerede mus og nåede 5 – 10 x 10 ⁶ neutrofiler i 1 ml blod efter 3 uger.

Protocol

Dyr: 5-7 uger gamle BALB / c-mus købes fra Harlan (Israel). Alle forsøg med dyr blev godkendt af hebraiske Universitets Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). Humane prøver: Indsamling af blod fra kræftpatienter og raske frivillige blev godkendt af Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB). 1. Induktion af neutrofiler med Anti-tumor egenskaber in vivo Brug af en Breast Cancer Mouse Model. BEMÆRK: Alle trin skal udføres ved h…

Representative Results

I en nylig undersøgelse identificeret vi en anti-metastatisk funktion for neutrofiler 6. Neutrofiler fra tumorbærende mus erhverver en cytotoksisk fænotype og har kapacitet til at dræbe tumorceller 6. Dette er i modsætning til neutrofiler fra naive mus, som ikke har nogen signifikant anti-tumor effekt 6. Adskillige af teknikkerne beskrevet i protokollen afsnit er blevet anvendt til at studere antitumor-neutrofil funktion in vitro og in vivo 6. <p class="jove_…

Discussion

Neutrofiler er de mest talrige af alle hvide blodlegemer og er de første respondenter i tilfælde af infektion og inflammation. Som sådan er de yderst følsomme over for eksterne signaler og er let aktiveres. Desuden neutrofiler har en meget kort halveringstid og en hurtig omsætning. Tilsammen udgør disse karakteristika rejser flere problemer i at arbejde med neutrofiler, således at der kræves unikke eksperimentelle strategier. For eksempel er der flere neutrofile rensning strategier, hver med sine egne fordele og…

Materials

CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells	ADCC	CRL-2539	Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate	Falcon	353047	Sterile
100 mm Tissue Culture Plate	Corning	430167	Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask	Nunc	156340	Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish	Miniplast, Ein Shemer, Israel	20090-01-017	Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835015-40-111	Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube	Miniplast, Ein Shemer, Israel	835050-21-111	Sterile
Falcon 12×75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube	Becton Dickinson	352058	Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm	Merck Millipore	PSMT010R1	Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate	Costar	3917	Sterile
Cell Strainer (40 mm)	BD Falcon	352340	Sterile
20G 1.5" Needle	BD Microlance 3	301300	Sterile
23G 1" Needle	BD Microlance 4	300800	Sterile
25Gx5/8" Needle	BD Microlance 5	300600	Sterile
0.3 ml Syringe with a 30Gx8mm Needle	BD Micro-Fine Plus Demi	320829	Sterile
9 mm Clips	BD, AutoClip	427631	Sterile
EasySep Magnet	STEMCELL Technologies	18000
MACS LS Separation Column	Miltenyi Biotech	130-042-201	Sterile
MidiMACS Separator Magnet	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS MultiStand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Microscope Glass Slide	Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo	J1800AMNZ
Orbital Shaker	Sky line, ELMI	S-3.02.10L
Plate Reader	TECAN	InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Sigma	A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)	BD Pharmingen	550891	Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)	Molecular Probes	C1157
Dextran T500	Sigma	31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma	H3149
Sodium azide (NaN3)	Sigma	S8032	Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder	Difco	225650
Zymosan A	Sigma	Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Sigma	D5796	Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium	Life Technologies	31985062	Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium	Sigma	R8758	Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated	Sigma	F9665	Sterile
L-Glutamine	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-020-1A	Sterile
Sodium pyruvate	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-042-1B	Sterile
Penicillin Streptomycin x1000 solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-031-5	Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-1	Sterile
PBSx10 without Ca2+ and Mg2+	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-023-5A	Sterile
HPLC grade water	J.T. Baker	4218-03	Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium	Life Technologies	A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS			Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO			Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution	Sigma	HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	02-016-1A	Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS			Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1119	Sigma	11191	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077	Sigma	10771	Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5	Promega	E153A	Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution	Promega	E1501	Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution	Sigma	MHS-32
PBS+0.5% BSA			Dissolve 2.5g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS+1% BSA			Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA			Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water                     and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3)			Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl)			Dissolve 9 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution			Dissolve 2 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution			Dissolve 16 g NaCl in 1000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide			Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution			Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B	Biological Industries, Beth HaEmek, Israel	03-046-1	Sterile
1 mg/ml Zymosan A			Resuspend 1 mg Zymosan A  in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube.                            Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave.            Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit	STEMCELL Technologies	18557
EasySep PE selection cocktail	STEMCELL Technologies	18151
the EasySep magnetic nanoparticles	STEMCELL Technologies	18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies	19257
FITC BrdU flow kit	BD Pharmingen	559619
MACS Neutrophil isolation kit	Miltenyi Biotec	130-097-658
Phagocytosis Assay Kit	Cayman Chemical Company	500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody	Biolegend	101302
Purified rat anti-Ly6G antibody	BD Pharmingen	551459	Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody	Biolegend	127608	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G	BD Pharmingen	551460	Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	65-1276	Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G	TONBO Biosciences	75-1276	Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b	BD Pharmingen	553310	Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1)	BD Pharmingen	553127	Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45	BD Pharmingen	553081	Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80	Abcam	ab60343	Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b	Biolegend	305103	Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)	BD Pharmingen	553927	Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody	BioLegend	100314	Clone 145-2C11