Визуализация хондроцитов интеркаляции и направленного распространения через Zebrabow клонального анализа клеточной хряща в эмбриональном Меккеля
Summary
Сотовый организация черепно костей давно предположили, но никогда непосредственно не визуализируется. Мульти-спектральный мечения клеток и в естественных условиях живут изображений позволяет визуализировать динамическое поведение клеток в данио нижней челюсти. Здесь мы подробно протокол для управления Zebrabow трансгенных рыб и непосредственно наблюдать клетки интеркаляции и морфологические изменения хондроцитов в хряще в Меккеля.
Abstract
Развитие позвоночных черепно структур требует точной координации миграции клеток, пролиферации, адгезии и дифференцировки. Паттерна хряща Меккеля, первый глотки арки производной, включает в себя миграцию черепно нервного гребня (CNC) клеток и прогрессивной разделов, пролиферацию и организацию дифференцированных хондроцитов. Несколько исследований описали миграции с ЧПУ во время нижней челюсти формообразования, но детали, как хондроциты достижения организации в росте и расширении хряща Меккеля, остается неясным. Sox10 ограничено и химически индуцированных Cre рекомбиназа-опосредованной рекомбинации создает перестановки различных флуоресцентных белков (RFP, YFP и CFP), тем самым создавая многоспектральной маркировки клеток-предшественников и их потомства, отражающие различные клоновых популяций. Использование конфокальной время киносъемки, это можно наблюдать хондроциты behaviили во время развития хряща данио Меккеля.
Мультиспектральное мечения клеток позволяет ученым, чтобы продемонстрировать расширение хондроцитов в Меккеля. Во время фазы расширения хряща Меккеля, который предвосхищает челюсть, хондроциты интеркалировать осуществить расширение, как они складывают в организованном одноклеточного слоистой подряд. Отказ этом организованного процесса интеркалирующего посредником расширение клеток обеспечивает сотовой механистическое объяснение гипоплазии нижней челюсти, что мы наблюдаем в нижней челюсти пороков развития.
Introduction
Черепно развитие требует сложных молекулярных, клеточных и тканевых взаимодействий ездить клеточной пролиферации, миграции и дифференциации 1,2, 3. Это жестко регулируется и сложный процесс, подлежит генетических и экологических возмущений, таких, что черепно-лицевые уродства являются одними из самых распространенных врожденных пороков развития 1-9. В то время как хирургические вмешательства остаются основой лечения черепно-лицевых аномалий, понимания основ развития имеет важное значение для будущих инноваций терапии. Таким образом, изучение морфогенеза и механизмов в конвергенции и расширения и интеграции клеток обеспечивает новые идеи в формировании скелета черепно 1.
Черепно нервного гребня мигрируют и заполнить первую глотки арки, а также форма парные челюстные процессы, которые проходят с образованием хряща Меккеля, который предвосхищает челюсть. Морфогенез ое хряща Меккеля требует хондроцитов организации через направленного распространения, поляризации клеток и дифференцировки 1,10. Тем не менее, запутанность хондроцитов организации в росте и расширении хряща Меккеля, остается неясным. Понимание динамическое поведение клеток является критическим для понимания врожденных пороков развития, влияющие на размер нижней челюсти, например, гипоплазией нижней челюсти фенотипов 11.
Эмбрионы рыбок данио предлагают много развития и генетические преимущества для детального изучения морфогенеза хряща Меккеля. Их генетический уступчивость, прозрачность, экс естественных и быстрое развитие мощные преимущества кредитования это хорошо для наблюдения клеточного движения и организации живой изображений 6. Использование клон трассировки инструменты, такие как: Sox10 KAEDE трансгенной линии, мы и другие очерчены нервного гребня происхождение эмбриональных черепно скелета 1,5. UsiН.Г. Sox10: ERT2-Cre с UBI: Zebrabow-М трансгенной линии, теперь можно исследовать детали сотовых движений во время черепно-лицевого развития. Zebrabow-М, является трансгенной линии разработана с убиквитиновой промоутер вождения выражение различных флуорофоров, каждый в окружении LOX сайтов 8. По умолчанию флюорофор Zebrabow-М Красный, выражая RFP. После индукции экспрессии Cre, то Zebrabow-М построить рекомбинирует и клетки выразить сочетание различных флуорофоров (ППП, СФП и YFP), создающих многоспектральной выражение в зародыше. Все дочерние клетки, которые делят с меченых клеток после рекомбинации затем клонально помечены, так что сотовые населения, которые вытекают из различных сопоставленными предшественников клонально помечены. К этому клонирование клеток маркировки, пролиферации и миграции клеток с клональной разрешением может следовать (фиг.1 и 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Альциановый синий и photoconvertible трансгенные линии, как описано выше дополняет друг с другом, чтобы определить сложный процесс хряща и развития костей. Тем не менее, в прямом эфире клеточной миграции и организация в течение органогенеза давно предположили, и косвенно продемонстрировал, но…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Alex Schier за любезно обмена трансгенной линии Zebrabow-M, Джеффри Бернс для вектора pDEST и Рене Этье-Daigle за отличную ухода рыбы объекта и линий.
ФИНАНСИРОВАНИЕ:
Мы благодарны за щедрую финансовую поддержку от NIDCR RO3DE024490 и Shriners больницы для детей (ECL) и пост-докторантов учебных стипендий от Shriners больницы для детей (LR и Ю. К.).
Materials
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Equipments | |||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
Referências
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. . Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
