Visualisation des chondrocytes intercalation et directionnel prolifération clonale via Zebrabow analyse cellulaire dans le cartilage de l'embryonnaire Meckel
Summary
L'organisation des cellules des os cranio-faciales a longtemps été supposé, mais jamais directement visualisées. Marquage des cellules multi-spectrale et en Live in vivo imagerie permet de visualiser le comportement des cellules dynamique dans la mâchoire inférieure du poisson zèbre. Ici, nous détaillons le protocole de manipuler Zebrabow poissons transgéniques et observons directement intercalation de cellules et les changements morphologiques des chondrocytes dans le cartilage de Meckel.
Abstract
Le développement des structures craniofaciales vertébrés exige une coordination précise de la migration cellulaire, la prolifération, l'adhérence et la différenciation. Modélisation du cartilage de Meckel, un premier pharyngée dérivé de voûte, implique la migration de la crête neurale crânienne (CNC) cellules et le cloisonnement progressif, la prolifération et l'organisation des chondrocytes différenciés. Plusieurs études ont décrit la migration CNC lors de la morphogenèse inférieure de la mâchoire, mais les détails de la façon dont les chondrocytes atteindre organisation dans la croissance et l'extension du cartilage de Meckel reste incertaine. Le SOX10 limitée et induite chimiquement recombinase Cre médiée par recombinaison génère des permutations des protéines fluorescentes distinctes (DP, YFP et CFP), en créant ainsi un marquage multi-spectrale de cellules souches et de leur descendance, ce qui reflète populations clonales distinctes. Utilisation confocale time-lapse photography, il est possible d'observer les chondrocytes behaviou au cours du développement du cartilage de Meckel le poisson zèbre.
Marquage cellulaire multispectrale permet aux scientifiques de démontrer extension des chondrocytes de Meckel. Pendant la phase d'extension du cartilage de Meckel, qui préfigure la mandibule, chondrocytes intercalent pour effectuer l'extension comme ils empilent dans une seule rangée de cellules en couches organisée. Échec de ce processus d'intercalation organisée à la médiation extension de cellules fournit l'explication mécanistique cellulaire pour mandibule hypoplasie que nous observons dans les malformations mandibulaires.
Introduction
Développement craniofaciale exige, les interactions cellulaires et tissulaires moléculaires complexes à conduire la prolifération cellulaire, migration et la différenciation 1,2, 3. Ce processus étroitement régulé et complexe est soumis à des perturbations génétiques et environnementaux, tels que des malformations cranio-faciales sont parmi les malformations congénitales les plus courantes 1-9. Bien que les interventions chirurgicales restent le pilier du traitement des anomalies crânio-faciales, la compréhension de la base de développement est essentiel d'innover futures thérapies. Par conséquent, l'étude de la morphogenèse et les mécanismes de la convergence et l'extension et l'intégration de cellules fournit de nouvelles indications sur la formation du squelette cranio-facial 1.
Crânienne migration de la crête neurale et remplir le premier arc pharyngien, processus mandibulaires forment alors jumelés qui se prolongent pour former le cartilage de Meckel, qui préfigure la mandibule. Morphogenèse of cartilage de Meckel l'organisation nécessite prolifération des chondrocytes par directionnel, la polarisation et la différenciation cellulaires 1,10. Cependant, la complexité de l'organisation des chondrocytes dans la croissance et l'extension du cartilage de Meckel reste incertaine. Comprendre le comportement dynamique de la cellule est essentielle pour comprendre les malformations congénitales affectant la taille mandibulaire, comme phénotypes mandibule hypoplasie 11.
Embryons de poisson zèbre offrent de nombreux avantages développementaux et génétiques pour étude détaillée du cartilage de la morphogenèse de Meckel. Leur traçabilité génétique, la transparence, ex vivo et le développement rapide des avantages puissants de prêt bien pour l'observation du mouvement et de l'organisation cellulaire par l'imagerie en direct 6. Utilisation des outils de la lignée de traçage, comme SOX10: lignée transgénique kaede, nous et d'autres avons délimité les origines de la crête neurale du squelette cranio-facial embryonnaire 1,5. Using l'SOX10: ERT2-Cre avec le ubi: Zebrabow-M lignée transgénique, il est maintenant possible d'explorer les détails des mouvements cellulaires au cours du développement cranio-facial. Le Zebrabow-M, est une lignée transgénique conçu avec le promoteur de l'ubiquitine de conduire l'expression de différents fluorophores, chacun flanqué par des sites Lox 8. Le fluorophore par défaut Zebrabow-M est rouge, exprimant RFP. Après induction de l'expression Cre, l'Zebrabow-M construire recombine et cellules expriment une combinaison de différents fluorophores (DP, CFP et YFP) créant expression multi-spectrale dans l'embryon. Toutes les cellules filles qui divisent des cellules marquées après l'événement de recombinaison par clonage sont ensuite marquées, de sorte que des populations de cellules qui dérivent de progéniteurs différentes sont juxtaposées par clonage étiquetés. En ce marquage cellulaire de clonage, les cellules prolifération et la migration à la résolution peuvent être suivies clonale (figure 1 et 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Lignées transgéniques bleu Alcian et photoconvertible que décrit ci-dessus complète les uns aux autres pour définir le processus complexe de cartilage et le développement des os. Cependant, la migration cellulaire en direct et l'organisation pendant l'organogenèse a longtemps été supposé et indirectement démontré mais jamais visualisé. Zebrabow-M lignée transgénique couplé avec un cartilage Cre spécifique permet l'observation en direct simultanée de tous ces événements distincts impliqué…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Alex Schier pour avoir bien voulu partager la lignée transgénique Zebrabow-M, Geoffrey Burns, pour le vecteur pDEST et Renee Ethier-Daigle pour l'excellence des soins de la facilité de poissons et de lignes.
FINANCEMENT:
Nous sommes reconnaissants pour le soutien généreux de financement de NIDCR RO3DE024490 et Hôpitaux Shriners pour enfants (ECL) et des bourses de formation post-doctorants de Hôpitaux Shriners pour enfants (LR et YK).
Materials
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Equipments | |||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
Referências
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. . Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
