भ्रूण मेकेल कार्टिलेज में Zebrabow क्लोनल सेल विश्लेषण के माध्यम से उपास्थिकोशिका अंतनिवेश और दिशात्मक प्रसार के दृश्य
Summary
Craniofacial हड्डियों की सेल संगठन लंबे समय से धारणा रही है लेकिन सीधे कल्पना की कभी नहीं रही है। मल्टी-स्पेक्ट्रल सेल लेबलिंग और विवो लाइव में इमेजिंग zebrafish निचले जबड़े में गतिशील सेल व्यवहार के दृश्य की अनुमति देता है। यहाँ, हम विस्तार प्रोटोकॉल Zebrabow ट्रांसजेनिक मछली हेरफेर करने के लिए और सीधे सेल मध्यनिवेश और मेकेल उपास्थि में chondrocytes की रूपात्मक परिवर्तन देखने।
Abstract
कशेरुकी craniofacial संरचनाओं के विकास सेल प्रवास, प्रसार, आसंजन और भेदभाव की सटीक समन्वय की आवश्यकता है। मेकेल उपास्थि, पहली बार एक ग्रसनी मेहराब व्युत्पन्न की patterning कपाल तंत्रिका शिखा (सीएनसी) कोशिकाओं के प्रवास और प्रगतिशील विभाजन, प्रसार और भेदभाव कर chondrocytes के संगठन शामिल है। कई अध्ययनों से निचले जबड़े morphogenesis दौरान सीएनसी पलायन का वर्णन किया है, लेकिन chondrocytes मेकेल उपास्थि के विकास और विस्तार में संगठन हासिल कैसे की जानकारी अस्पष्ट बनी हुई है। sox10 प्रतिबंधित है और रासायनिक प्रेरित Cre Recombinase की मध्यस्थता पुनर्संयोजन जिससे अलग प्रतिरूप आबादी को दर्शाती है, पूर्वज कोशिकाओं और उनके संतान की एक मल्टी स्पेक्ट्रल लेबलिंग बनाने, अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी, YFP और सीएफपी) के क्रमपरिवर्तन उत्पन्न करता है। कोंफोकल समय चूक फोटोग्राफी का उपयोग करना, यह chondrocytes निरीक्षण करने के लिए संभव है behaviया zebrafish मेकेल उपास्थि के विकास के दौरान।
Multispectral सेल लेबलिंग मेकेल chondrocytes के विस्तार प्रदर्शित करने के लिए वैज्ञानिकों को सक्षम बनाता है। जबड़ा prefigures जो मेकेल उपास्थि, के विस्तार के चरण के दौरान, chondrocytes वे एक संगठित एकल कोशिका बहुस्तरीय पंक्ति में ढेर के रूप में विस्तार करने के लिए प्रभावी intercalate। सेल विस्तार मध्यस्थता करने के लिए यह आयोजन किया intercalating प्रक्रिया की विफलता हम जबड़े विकृतियों में निरीक्षण कि hypoplastic जबड़ा के लिए सेलुलर यंत्रवत विवरण प्रदान करता है।
Introduction
Craniofacial विकास सेल प्रसार, प्रवास और भेदभाव 1,2, 3 ड्राइव करने के लिए जटिल आणविक, सेलुलर और ऊतक बातचीत की आवश्यकता है। इस कसकर विनियमित और जटिल प्रक्रिया craniofacial विकृति सबसे आम जन्म विकृतियों 1-9 लोगों में से हैं कि इस तरह के आनुवांशिक और पर्यावरणीय अव्यवस्थाएं, के अधीन है। शल्य हस्तक्षेपों विकास के आधार को समझने, craniofacial विसंगतियों के लिए उपचार का मुख्य आधार बने हुए हैं, वहीं भविष्य उपचार नया करने के लिए आवश्यक है। इसलिए, अभिसरण और विस्तार और सेल एकीकरण में morphogenesis और तंत्र के अध्ययन के craniofacial कंकाल 1 के गठन में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
कपाल तंत्रिका शिखा विस्थापित और पहली ग्रसनी मेहराब जबड़ा prefigures जो मेकेल उपास्थि, फार्म के लिए करता हूं कि, तब बनती फार्म जबड़े प्रक्रियाओं आबाद। Morphogenesis ओमेकेल उपास्थि च दिशात्मक प्रसार, सेल ध्रुवीकरण और भेदभाव 1,10 के माध्यम से उपास्थिकोशिका संगठन की आवश्यकता है। हालांकि, मेकेल उपास्थि के विकास और विस्तार में उपास्थिकोशिका संगठन की जटिलता अस्पष्ट बनी हुई है। गतिशील सेल व्यवहार को समझना ऐसे hypoplastic जबड़ा phenotypes के रूप में 11 जबड़े के आकार को प्रभावित जन्मजात विकृतियों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
Zebrafish भ्रूण मेकेल उपास्थि morphogenesis के विस्तृत अध्ययन के लिए कई विकासात्मक और आनुवंशिक लाभ प्रदान करते हैं। उनके आनुवंशिक शिक्षणीयता, पारदर्शिता, पूर्व vivo और तेजी से विकास रहते इमेजिंग 6 से सेल आंदोलन और संगठन के अवलोकन के लिए यह अच्छी तरह से उधार शक्तिशाली लाभ कर रहे हैं। ऐसे sox10 के रूप में वंश अनुरेखण उपकरण, का प्रयोग: Kaede ट्रांसजेनिक लाइन, और हम दूसरों भ्रूण craniofacial कंकाल 1,5 के तंत्रिका शिखा मूल चित्रित किया है। Usiयूबीआई के साथ ERT2-CRE: sox10 एनजी Zebrabow एम ट्रांसजेनिक लाइन, यह Craniofacial विकास के दौरान सेलुलर आंदोलनों की जानकारी का पता लगाने के लिए अब संभव है। Zebrabow-एम, अलग fluorophores की अभिव्यक्ति ड्राइविंग यूबीक्यूटिन प्रमोटर, Lox साइटों 8 से घिरे प्रत्येक के साथ इंजीनियर एक ट्रांसजेनिक लाइन है। Zebrabow एम डिफ़ॉल्ट fluorophore आरएफपी व्यक्त लाल है। रचनात्मक अभिव्यक्ति के शामिल होने के बाद, Zebrabow एम recombines निर्माण और कोशिकाओं भ्रूण में मल्टी स्पेक्ट्रल अभिव्यक्ति बनाने अलग fluorophores (आरएफपी, सीएफपी और YFP) का एक संयोजन व्यक्त करते हैं। अलग Juxtaposed पूर्वज से निकाले जाते हैं कि कि सेल आबादी clonally चिह्नित कर रहे हैं, ताकि पुनर्संयोजन घटना के बाद लेबल की कोशिकाओं से विभाजित है कि सभी बेटी कोशिकाओं तो clonally, लेबल रहे हैं। यह क्लोनिंग सेल लेबलिंग करके, प्रतिरूप संकल्प के साथ कोशिकाओं के प्रसार को और प्रवास (चित्रा 1 और 2) का पालन किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर से एक दूसरे के पूरक के रूप में वर्णित Alcian नीले और photoconvertible ट्रांसजेनिक लाइनों उपास्थि और हड्डी के विकास की जटिल प्रक्रिया को परिभाषित करने के लिए। हालांकि, जीवोत्पत्ति के दौरान लाइव सेलुलर प्रवास और स…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों कृपया मछली सुविधा और लाइनों के उत्कृष्ट देखभाल के लिए Zebrabow एम ट्रांसजेनिक लाइन, pDEST वेक्टर के लिए जेफ्री बर्न्स और रेनी Ethier-Daigle साझा करने के लिए एलेक्स Schier धन्यवाद।
अनुदान:
हम बच्चों के लिए श्राइनर्स हॉस्पिटल से बच्चे (ईसीएल) और पोस्ट डॉक्टरेट प्रशिक्षण फैलोशिप के लिए NIDCR RO3DE024490 और श्राइनर्स हॉस्पिटल से उदार वित्तीय सहायता (एलआर और वाईके) के लिए आभारी हैं।
Materials
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Equipments | |||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
Referências
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