Visualisering av kondrocyttransplantation interkalering och riktnings spridning via Zebrabow Kloncellanalys i embryonala Meckels Brosk
Summary
Cell organisation av kraniofaciala ben har länge varit en hypotes men aldrig direkt visualiseras. Multi-spektral cellmärkning och in vivo levande avbildning möjliggör visualisering av dynamiska cellbeteende i zebrafisk käken. Här, att vi i detalj protokollet manipulera Zebrabow transgen fisk och direkt observera cell inlagring och morfologiska förändringar av kondrocyter i Meckels brosk.
Abstract
Utveckling av ryggradsdjur kraniofaciala strukturer kräver noggrann samordning av cellmigration, proliferation, vidhäftning och differentiering. Mönstring av Meckels brosk, en första svalg båge derivat, innebär migration av hjärn neurallisten (CNC) celler och den progressiva partitione, spridning och organisation av differentierade kondrocyter. Flera studier har beskrivit CNC migration under underkäken morfogenes, men detaljerna i hur kondrocyterna uppnår organisation i tillväxt och utvidgning av Meckels brosk är fortfarande oklart. Den sox10 bundet och kemiskt inducerad Cre-rekombinas-förmedlad rekombination genererar permutationer av distinkta fluorescerande proteiner (RFP, YFP och GFP), och därigenom skapa en multispektral märkning av progenitorceller och deras avkomma, vilket återspeglar distinkta klonala populationer. Med hjälp av konfokal time-lapse fotografering, är det möjligt att observera kondrocytema behavieller under utveckling av zebrafisk Meckels brosk.
Multispektrala cellmärkning gör det möjligt för forskarna att visa förlängning av Meckels kondrocyter. Under förlängningsfasen av Meckels brosk, vilket förebådar underkäken, kondrocyter inskjuta att åstadkomma utsträckning som de stack på ett organiserat encelliga lager rad. Misslyckande av detta organiserade interkalerande process för att förmedla cell förlängning ger den cellulära mekanistisk förklaring för hypoplastic käken som vi ser i underkäken missbildningar.
Introduction
Kraniofaciala utveckling kräver komplexa molekylära, cellulära och vävnadsinteraktioner att driva celltillväxt, migration och differentiering 1,2, 3. Detta hårt reglerad och komplicerad process är föremål för genetiska och miljömässiga störningar, så att kraniofaciala missbildningar är bland de vanligaste födelse missbildningar 1-9. Även kirurgiska ingrepp förblir grunden för behandling av kraniofaciala anomalier, att förstå utvecklingen grunden är viktigt att förnya framtida terapier. Därför studera morfogenes och mekanismerna i konvergens och utbyggnad och integration cell ger nya insikter i bildandet av den kraniofaciala skelettet 1.
Kraniell neurallisten migrera och fylla den första svalget bågen, sedan bilda parade mandibulära processer som sträcker sig för att bilda Meckels brosk, vilket förebådar underkäken. Morfogenes of Meckels brosk kräver kondrocyt organisationen via riktad spridning, cell polarisering och differentiering 1,10. Förblir dock intrikat av chondrocyte organisation i tillväxt och utvidgning av Meckels brosk oklar. Förstå dynamisk cellens beteende är avgörande för att förstå medfödda missbildningar som påverkar mandibular storlek, såsom hypoplastiska käken fenotyper 11.
Zebrafisk embryon erbjuder många utvecklings- och genetiska fördelar för detaljerad studie av Meckels brosk morfogenes. Deras genetiska spårbarhet, öppenhet, ex vivo och snabb utveckling är kraftfulla fördelar utlåning det bra för observation av cellrörelse och organisation av levande avbildning 6. Använda linje-spårning verktyg, såsom sox10: kaede transgen linje, har vi och andra avgränsade neurallisten ursprung embryonala kraniofaciala skelettet 1,5. USIng sox10: ERT2-Cre med ubi: Zebrabow-M transgen linje, är det nu möjligt att utforska detaljer om cellulära rörelser under kraniofaciala utveckling. Den Zebrabow-M, är en transgen linje framtagen med ubiquitin-promotorn som driver uttrycket av olika fluoroforer, vardera flankeras av lox-ställen 8. Den Zebrabow-M standard fluorofor är röd, som uttrycker RFP. Efter induktion av Cre uttryck, den Zebrabow-M konstruera rekombinerar och celler uttrycker en kombination av olika fluoroforer (RFP, GFP och YFP) skapar multi-spektrala uttryck i embryot. Alla dotterceller som skiljer från de märkta cellerna efter rekombinationshändelsen sedan klonalt märkta, så att cellpopulationer som härrör från olika intill varandra belägna stamceller är klonalt märkta. Genom denna kloningscellmärkning, kan celler spridning och migration med klon upplösning följas (Figur 1 och 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Alcianblått och photoconvertible transgena linjer som beskrivits ovan kompletterar varandra för att definiera den komplicerade processen att brosk och ben utveckling. Dock har levande cellulär migration och organisation under organogenesen länge hypoteser och indirekt visat men aldrig visualiseras. Zebrabow-M transgen linje tillsammans med en brosk specifik Cre medger samtidig levande observation av alla dessa olika händelser som är involverade i ben- och broskbildning. Denna teknik gör det möjligt att studera u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Alex Schier för vänligt dela Zebrabow-M transgen linje, Geoffrey Burns för pDEST vektorn och Renee Ethier-Daigle för utmärkt hand om fisken anläggningen och linjer.
FINANSIERING:
Vi är tacksamma för generösa finansieringsstöd från NIDCR RO3DE024490 och Shriners Hospitals for Children (ECL) och postdoktorsutbildningsstipendier från Shriners Hospitals for Children (LR och YK).
Materials
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μL stock aliquots at 50mg/mL |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Equipments | |||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
Referências
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. . Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
