Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.
合成酵母ゲノムプロジェクト(Sc2.0)は16デザイナー酵母染色体を構築し、単一の酵母細胞にそれらを組み合わせることを目指しています。 1合成染色体、synIII 1、および1つの合成染色体腕、synIXR 2とデートするには、構築し、それらのインビボ機能は、対応する野生型の染色体の不存在下で検証されています。 Sc2.0染色体の重要な設計上の特徴は、それらの野生型対応物から合成染色体の分化を可能にするオープンリーディングフレーム(ORF)内の短い、再符号化された配列であるPCRTags、の紹介です。 PCRTagは合成または野生型のいずれかの染色体に選択的にアニールするプライマーおよびDNAの各タイプの存在/非存在は、単純なPCRアッセイを用いて試験することができます。 PCRTagアッセイの標準読み出しは、アガロースゲル電気泳動により、アンプリコンの存在/非存在を評価することです。しかし、1.5キロバイトとAgあたり1の平均PCRTagアンプリコン密度〜12 Mbののenomeサイズは、完成したSc2.0ゲノムは、およそ8,000 PCRTagsをエンコードします。スループットを向上させるために、我々はqPCRTag分析呼び出すPCRTagジェノタイピングのためのリアルタイムPCRベースの検出アッセイを開発しました。ワークフローは、私たちは1回の実験で合成および野生型プライマー対の両方で768 PCRTagsまでテストすることができ、1,536マルチウェルプレートで500 nlの反応を指定します。
Sc2.0、または合成酵母ゲノムプロジェクト( www.syntheticyeast.orgは )、完全に合成真核生物のゲノムを設計し、構築することを目標としています。出発点として、 サッカロミセス·セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)3の高キュレーションゲノム配列を使用して、16リニア染色体のそれぞれは、セルの適性を維持し、ゲノム安定性の向上、および遺伝的柔軟性を増大させる特定の設計原理のセットに適合するように再設計されています。例えば、このような繰り返しのような不安定化要素はSc2.0染色体から削除されます。 TAG停止コドンのすべてのインスタンスは、非遺伝的にコードされたアミノ酸の導入のための最終的な株でコドンを「解放」するTAAに再符号化されます。またのCre-lox系で有効に誘導進化システム、スクランブルは、新規な構造4を有する誘導体ゲノムを生成するために、これまでにない能力を可能にします。
<p class="「jove_contentは" "> Sc2.0ゲノム中のもう一つの主要な設計要素は、合成および野生型DNAの追跡を可能にするために、DNAの透かしとして機能PCRTags、の紹介です。 PCRTagsは、合成染色体上のORFで短い、再符号化されたセグメントです。 PCRTag配列は、合成および野生型の染色体間DNAレベルで異なるが、コードされたタンパク質は、アミノ酸配列、従って、おそらく、機能的に同一です。 PCRTag配列は、具体的に選択的増幅( 図1A)を容易にするためのプライマー結合部位として設計されています。 PCRTag設計は、典型的には58°Cと60°Cとの間の融解温度を有する天然配列(最小33%)よりも〜60%異なる合成配列を再符号得GeneDesign 5,6中で最も異なる」アルゴリズムを使用して行われます200〜500塩基対2との間のアンプリコンの長さ。これらの領域はに知られているように再符号化は、各ORFの最初の100塩基対の中に許可されていませんコドン使用頻度7の面で特別な好みを持っています。一緒に、これらの設計ルールは、合成および野生型PCRTagプライマー対は、排他的に( 図1B)は、それぞれ、合成および天然のDNAに結合し、増幅することによりPCR条件の単一セットの下で、ほとんどすべてのPCRTagsの高性能化に有利に働きます。
図1:PCRTagの概略図(A)PCRTagsはSc2.0染色体上の遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)内の配列を再符号化されます。 (B)の合成(SYN)と野生型(WT)PCRTagプライマーはもっぱら、それぞれ結合し、(のgDNA)を合成し、野生型ゲノムDNAを増幅します。ここに示されているテンプレートとしてWTまたは半synVIL2たgDNAのいずれかを使用して13 PCRTagプライマー対を試験、染色体6の左腕の約30 kbの断片の分析です。多くの場合、単一のORFは、複数のPを符号化しますCRTag。 PCRTagアンプリコンの存在/非存在は、アガロースゲル電気泳動によって評価します。 PCRTagアンプリコンは200 bpのから500塩基対のサイズの範囲。パネルの下部にあるより速く移動する種は、プライマー二量体です。
PCRTag分析はSc2.0染色体の組み立てにおいて重要なツールであることが証明されました。 20-30 PCRTagsをコードする合成DNAの典型的な実験30〜50キロバイトでは、対応する野生型DNA 1,2,8を置き換えるために酵母細胞に形質転換します。 PCRTag分析はその後DNAのセグメントにまたがる合成ではなく、野生型PCRTags、またはいわゆる「勝者」をコードする形質転換体を同定するために使用されます。これは、「勝者」を識別するために、複数の形質転換体を試験することが通常必要であるため、PCRTag分析のスループットおよびコストが重要な考慮事項です。現在、2 Sc2.0の染色体がSc2.0ゲノムの10%未満を表す、(synIII 1及びsynIXR 2)完了した、ALTハフより残りの染色体の半分以上は、現在、合成およびアセンブリを受けています。このプロジェクトに必要なPCRTag分析の規模は、高速合成DNAおよび野生型DNAの有無をゲルを実行して、手動で得点する能力を上回っています。
我々は、アガロースゲル電気泳動の使用を回避するために、リアルタイムPCRを使用してワークフローを開発したPCRTagアッセイのスループットを向上させます。ワークフローは、私たちはNL 500に反応を小型化することができ、1,536マルチウェルプレートの各ウェルにテンプレートDNAおよびプライマー、および1,536定量PCRサーマルサイクラーを転送するために、ナノスケール音響液体ディスペンサーを定量PCRマスターミックスを配布するバルク液体ディスペンサを利用し、スループットを最大化します。さらに分析を自動化することができます。ハイスループットジェノタイピングこのタイプのプロトコルは、複数の遺伝子座で多くのクローンの分析を必要とするプロジェクトに一般にする必要があります。
それが顕著に高いスループットを可能にするようPCRTagジェノタイピングアッセイにリアルタイムPCR検出の組み込みはSc2.0プロジェクトのための重要な開発です。前のワークフローでは、384ウェルPCRプレート、1.5時間、熱サイクルの実行時間、アガロースゲル電気泳動、およびゲルの手動注釈に2.5μlの反応を指定しました。
qPCRTag分析と呼ばれるここで紹介するワークフローは、いくつかの主要なボトルネックを克服しています。まず、qPCRTagランは約1時間で、(プレートのセットアッププラス時間を実行します)最初から最後まで、加工することができる単一の実験中に4×384ウェルプレートを凝縮します。それはqPCRTag分析用ウェルあたり試薬コストが低いスループットアガロースゲルベースのアプローチと同等のことに留意することが重要です。しかし、ゲル電気泳動および手動注釈を回避することによって、qPCRTagワークフローは大きな利点であり、時間と労力の大幅な節約を、提供します。重要なことqPCRTagワークフローは専用ですオートメーションとtirely互換性があります。
PCRTagアッセイの出力としてリアルタイム検出を用いて、主要な関心事は、偽陽性と偽陰性の割合です。 PCRTagプライマーが最初にリアルタイムPCRでの使用のために設計されていないので、全てのプライマー対は、この出力での使用のために適切であることが期待されます。このためには、フロントアップ、リアルタイムベースのアッセイでは動作しないサブセットを除外するために、すべてのPCRTagプライマー対の機能と特異性を検証することが重要です。例えば、染色体3 PCRTag偽陽性及び陰性のバイ及び大再現性のあるリアルタイムPCRデータ( 図2および図3)、これらはさらなる分析から除外することができます。また、失敗することが知られているプライマー対(ゲル電気泳動によって評価し、 図 ら AnnaluruのS6及びS7に示す。1)も排除することができます。これは、簡単にexclu単純に達成されます音響伝達プロトコルを設定丁不良プライマー対。
ほとんどのハイスループットアッセイのように、私たちはさらに下流の検証に値する形質転換体を同定するために、一次スクリーニングとしてリアルタイムPCRTag検出を使用します。続いて、二次スクリーニングのためのゴールドスタンダードは、読み出しとしてゲル電気泳動でPCRTag解析のままになります。 Sc2.0ためPCRTag解析の適用を超えて、ハイスループットで最先端のナノスケールの液体ハンドリングシステムを組み合わせたリアルタイムPCR技術は、迅速で自動化された分析を可能にし、多くの分野に影響を与える可能性を有します。たとえば、このワークフローは、ハイスループットライブラリースクリーニング、伝染病の診断、microbiome分析し、同時に複数の遺伝子座を変更しようとする最先端のゲノム編集手法に適用することができます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、国立科学財団助成MCB-0718846および米国防総省の国防高等研究計画庁(JDBに)契約N66001-12-C-4020によって部分的にサポートされていました。 LAMは、自然科学とカナダの工学研究評議会からのポスドクフェローシップによって資金を供給されました。この記事の公開は、ロシュが主催されています。
Yeast gDNA prep | |||
yeast gDNA | custom | custom | template for real time PCR |
Acid-washed glass beads (0.5mm) | Sigma | G8772 | yeast cell lysis |
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Invitrogen | 15593-031 | yeast cell lysis |
5432 Mixer | Eppendorf | 5432 | yeast cell lysis |
Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | yeast cell lysis |
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | gDNA quantification |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | gDNA quantification |
Labcyte 384PP plate | Labcyte | P-05525 | gDNA source plate |
DNA Green Mastermix prep and dispensing | |||
LightCycler 1536 DNA Green | Roche | 5573092001 | real time PCR mastermix |
1.5mL Microfuge Tube Holder | ARI | EST BD060314-1 | microfuge tube holder for deck of Cobra |
LightCycler 1536 Multiwell Plate | Roche | 5358639001 | |
Cobra liquid handling system | Art Robbins Instruments | 630-1000-10 | dispense qPCR master mix into 1536 plate |
PCR Plate Spinner | VWR | 89184-608 | cenrifugation of 1536 plate |
Template and primer dispensing | |||
PCRTag primers | IDT | custom | premixed forward and reverse, [50uM] each |
TempPlate pierceable sealing foil, sterile | USA Scientific | 2923-0110 | temporary seal for PCRTag primer plates |
Labcyte LDV 384 well plate | Labcyte | LP-0200 | pre-mixed primer source plate |
Echo 550 Liquid Handler | Labcyte | transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate | |
Plateloc Thermal Microplate Sealer | Agilent | G5402-90001 | heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run |
Clear Permanent Seal | Agilent | 24212-001 | optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate |
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage | Agilent | G5402-20008 | can substitute ~2mm thick washers |
Sorvall Legend XTR | Thermo Scientfic | 75-004-521 | centrifuge heat sealed 1536 plate |
Industrial Air Compressor | Jun Air | 1795011 | to run the Echo and Heat Sealer |
Real Time PCR | |||
LightCycler 1536 | Roche | requires 220V outlet |