Planar Gradient Diffusion System för att undersöka Chemotaxis i en 3D kollagenmatris

Summary

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Abstract

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Introduction

Den föredragna rörelsen hos celler mot en koncentrationsgradient, känd som kemotaxi, spelar en viktig roll i patologiska och fysiologiska processer i kroppen. Sådana exempel är hud och slemhinnor sårläkning ^1, morfogenes ^2, inflammation ^3, och tumörtillväxt ^4,5. Det har också visat sig att cancerceller kan migrera genom både individuella och kollektiva cellmigrationsstrategier ^6. Dessutom kan diffusionssystem instabilitet mekanismer inducerar separation av enkla eller klustrade celler från en tumör kropp / object och sedan kan invandra till en källa av näringsämnen och därmed invadera större områden och vävnader ^7.

Dessutom har det visat sig att olika mekanismer migrations kan vara aktiva i 2D och i 3D, på grund av olika roller adhesionsmolekyler ^8. Därför en övergång till fysiologiskt relevant in vitro-analyser undersöka cellmotilitet i en measureable och enkelt sätt är av betydelse för att förstå cellrörelse fenomen ^9. Tyvärr, det är svårt att analysera cellmigration, en omfattande kvantifierbar chemotaxis analys kräver oftast en lång mödosam metod, som bygger på mätning av objektiva cellmotilitet och transportfenomen modeller.

Tidigare experimentella metoder för att undersöka cell kemotaxi inkluderar Boyden kammare ¹⁰ och under agaros analys ^11. Men inom dessa tidiga analyser, cellmigration Experiment har inte övervaka rörelsen i avseende på tiden. Mer, viktigare, koncentrationsgradienter används för experimenten var inte väl definierade eller helt klarlagda medan endast upprätthålla signaler för inte mer än ett fåtal timmar. Dessutom tidig kemotaxi kammarförsök begränsas cellmigration till två dimensioner och inte tillåter en att övervaka kinetiken migration ^12. Om man tittar på Boyden kammare, en slutpunkt analysskulle inte tillåta forskare att observera migration visuellt och kunde inte direkt skilja kemotaxi (riktad rörelse) från kemokines (slumpmässiga rörelser). Dessutom har flera variabler-skillnader i porstorlek och tjocklek av membran gjorda kammaren mycket svårt att enkelt reproducera och dolde migrerande reaktion av celler till kemokiner ^13,14.

Med den nya förståelsen för mikrofluidik, har nya avdelningar och mikro enheter undersökts som ett instrument för att undersöka cell förflyttning enligt mellanrumsflödesförhållanden eller chemotaxis ^15,16. Under dessa nya enheter har nya cell statistik infördes och undersökas, liksom effekten av skjuvspänningen på en cell ^17,18. Tyvärr, tidigare och nuvarande mikroflödes kemotaxi kammare begränsade studier av cellmigration till 2D-substrat-en viktig bakslag eftersom många biologiska processer, inklusive tumörcellinvasion och metastas, och immune cellmigration, involvera 3D migration.

Direkt observation kamrar-var en kemoattraherande lösning är i kontakt med en 3D-gel innehållande celler har också också rapporterats ^19,20. Dessa kammare har två avdelningar, en som innehåller en chemoattractant och en som innehåller celler, förenas bredvid varandra horisontellt ²¹ eller som koncentriska ringar ^22. Dessa system är pekade i rätt riktning, men inte hålla ett kemotaxi systemet under en längre tid.

Dessutom har forskarna också undersökt diffusiviteten genom kollagenmembran i dialysceller, liksom spridning av spårmolekyler genom kollagen prover utsattes för hydrostatiskt tryck ^23-25. Vissa diffusion experiment i kollagengeler lita på fysikaliska och kemiska modifieringar av gelén med hjälp av magnetfält och kemisk inkorporering ^26. En populär metod för att modellera diffusivitet i collaGenous vävnader bygger på fluorescens avbildning av kontinuerlig punkt fotoblekning. Denna metod har visat anisotropi i diffusionskoefficienterna av makromolekyler i orienterade kollagen vävnader. Ändå har fotoblekning använts i ledbrosk och inte kollagenmatriser. Medan liknande, måste nödvändiga modellerings experiment genomföras specifikt förstå diffusionskoefficient kollagengeler. Ännu viktigare, inte de system som inte utnyttjar ett förfarande för mätning av cellstyrke.

Tyvärr, de flesta system verkar sakna en eller två nyckelfaktorer för ett idealiskt system: det gör det möjligt att spåra cell, en diffusionsgradient förståelse med en kemotaktisk faktor genom matrisen, en relativt enkel installation med en enkel reproducerbarhet, minimering av cell-cell interaktioner, och förmågan att mäta måttenheter för kvantifiering (dvs, hastighet, styrka, specifik koncentrations). Moghe et al., </em> ²⁷ föreslagit ett system som uppfyllde de flesta av dessa krav i vilka cellerna ursprungligen dispergerade i gelén istället för koncentrerade på filterytan, men var svåra att mäta krafter som cellen genererar.

För detta ändamål, presenterar vi en plan gradient diffusionssystem att undersöka chemotaxis i en 3D kollagenmatris, vilket gör att man kan övervinna moderna diffusionskammaren begränsningar av befintliga analyser, som bygger på tidsförlopp mikroskopi, tillsammans med bildanalysteknik för att mäta cell krafter i en 3D-miljö. Detta protokoll ger en enkel, men ändå innovativt sätt att skapa en enkel 3D diffusionskammare som kan användas för att undersöka 3D kemotaxi i olika celler.

Protocol

1. 3D mögel design och delar Mögel Innan arbete, få en silikonelastomer kit, en levande cell imaging kammare, en 22 mm täckglas, och en bearbetad aluminium metall kub med måtten 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Förbered levande cell imaging kammare för formning genom att placera täck i bottenhållaren och montera resten av kammaren enligt anvisningar från leverantören. Nästa, med hjälp av pincett, placera bearbetad aluminium metall kub i mitten av den levande cell imaging kammare b…

Representative Results

Förmågan hos denna analys för att exakt bedöma migreringen av cellen är beroende av en god inställning av systemet. Därför är det viktigt för se till att utforma diffusionssystem formen exakt och tar stor omsorg att placera både hydrofoba och hydrofila täck, som visas i figur 1. Om systemet är rätt utformad och under diffusion modellering skede säkerställa att hitta en mycket god linjär startlinjen, är en möjlighet att uppnå fin fluorescerar bilder, såsom visas i fig 2,</str…

Discussion

De mest kritiska stegen för framgångsrika diffusion experiment med eller utan celler är: korrekt inrättande av formaggregatet; utveckla nödvändig fingerfärdighet för att undvika skador vid utvinning av hydrofoba täck; garantera att hitta en mycket god linjär startlinjen för att korrekt beräkna diffusionskoefficienten; korrigera experimentella beräkningar av både kollagen och kemoattraherande; korrekt användning av levande cell imaging system för att säkerställa matris inte torka ut; och bibehålla en s…

Materials

Silicone elastomer kit	Dow Corning Corp	182 SIL ELAST KIT .5KG	a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	CMB for 18mm round coverslips
22mm Glass Coverslip	Fisher Scientific	NC0180281	Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife	X-Acto	X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane	Sigma-Aldrich	281778-5ML
Glutaraldehyde	Polysciences, Inc	00216A-10	Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube	Fisher Scientific	14-432-22	Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass petri dish	Fisher Scientific	08-747A	Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm)
Forceps	Fisher Scientific	22-327-379	Fine Point Forceps
Cover glasses	Fisher Scientific	12-518-105A	Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl	Gelest	SIT8174.0
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane	Sigma-Aldrich	296090	Hexane
			anhydrous, 95%
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool	Lunzer	PV-081-3	Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length
Vacuum grease	Dow Corning	14-635-5C	High-Vacuum Grease
15 ml tube	Fisher Scientific	14-959-49D	15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10X phosphate buffered solution	Fisher Scientific	BP399-500	1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1N sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	38215	Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail	BD Biosciences	354236	Rat tail
Micro centrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-332	Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped
Carboxylate-modified microspheres	Invitrogen	F-8813	Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine	Sigma-Aldrich	83689	Rhodamine B for fluorescence