Instillatie en Fixatie Methoden Nuttig in Mouse Lung Cancer Research
Summary
Het doel van dit artikel is om eenvoudige methoden die sterk zal helpen bij de opzet en analyse van de muis longen met longkanker of andere aandoeningen te beschrijven. We presenteren 3 protocollen eenvoudig en betrouwbaar uit te voeren long instillaties, fixatie, en longvolume metingen.
Abstract
De mogelijkheid om live agenten, cellen, of chemicaliën inboezemen direct in de longen zonder verwonden of doden van de muizen is een belangrijk instrument bij longkanker onderzoek. Hoewel er een aantal methoden die zijn gepubliceerd toont hoe muizen intuberen voor longfunctie metingen geen daarvan zonder problemen waarvan de snelle tracheale instillatie in grote cohorten muizen. In dit document, wordt een eenvoudige en snelle methode beschreven dat een onderzoeker in staat stelt dergelijke instillations voeren op een efficiënte wijze. De methode heeft geen speciaal gereedschap of verlichting nodig en kan worden geleerd met zeer weinig praktijk. Het gaat verlamming een muis, een kleine incisie in de nek van de trachea te visualiseren, en vervolgens direct inbrengen van een intraveneuze catheter. De kleine incisie wordt snel afgesloten met weefsel lijm, en de muizen zijn toegestaan om te herstellen. Een ervaren student of technicus kan instillaties doen tegen een gemiddelde koers van 2 min / muis. Eenmaal thij kanker wordt vastgesteld, is er vaak behoefte aan kwantitatieve histologische analyse van de longen. Traditioneel pathologen meestal niet de moeite om de longen inflatie standaardiseren tijdens fixatie en analyses zijn vaak gebaseerd op een scoresysteem dat nogal subjectief kunnen zijn. Hoewel dit soms voldoende toereikend grove schatting van de grootte van een longtumor, een fatsoenlijk stereologische kwantificeren longstructuur of cellen vereist een reproduceerbare fixatie procedure gevolgd longvolume gemeten. Hier beschrijven we eenvoudige betrouwbare procedures voor zowel de vaststelling van de longen onder druk en vervolgens nauwkeurig de vaste longvolume te meten. Het enige vereiste is een laboratoriumbalans die nauwkeurig over een bereik van 1 mg 300 g. De hier gepresenteerde dus procedures kan sterk verbeteren van de mogelijkheid om longkanker te creëren, te behandelen en te analyseren bij muizen.
Introduction
Om een aantal redenen, longkanker is niet uitgebreid bestudeerd bij muizen. Een reden hiervoor is dat de toegang tot de long zeer moeilijk in vivo en kwantitatieve analyse van vaste longen niet algemeen gedaan. De in dit artikel beschreven methoden ontwikkeld om deze situatie te verhelpen. De doelen hierin zijn eenvoudige methoden die sterk zal helpen bij de opzet en analyse van de muis longen met longkanker of andere aandoeningen te beschrijven. Hoewel geen van deze benaderingen is volledig nieuw, zij niet samen voorgesteld als stand-alone werkwijzen die op vereenvoudigde wijze beschreven.
Er zijn een aantal handschriften die werkwijzen beschreven voor intubatie van de muizenlong hoofdzakelijk om hem te doen repeat longfunctie of bronchoalveolaire lavage individuele muizen in longitudinale studies. Sinds die originele papieren, zijn er verschillende andere kranten die verschillende benaderingen beschreven mous geweeste intubatie 1 -9. Hoewel al deze werkwijzen kunnen succesvol worden gebruikt, zij vereisen gewoonlijk aanzienlijke training en vaak niet zonder triviale uitvalpercentage. Bovendien, teneinde longfunctie metingen uitvoeren, de canule moet de trachea voldoende compact te passen, zodat er geen luchtlekkage. Echter, een praktisch gebruik intubatie voor bepaalde agentia (kankercellen of andere beledigingen) of therapeutische middelen rechtstreeks aan de longen. Een dergelijke procedure niet een strakke montage canule noch geavanceerde longfunctie apparatuur. De nieuw kenmerk van deze werkwijze hier gaat om een kleine chirurgische procedure die de intubatie mogelijk maakt zonder mogelijkheid van de canule die in de slokdarm. Deze eenvoudige benadering maakt succesvolle intubatie met relatief weinig opleiding of ervaring. Maar liefst 30 muizen / uur kan worden behandeld met behulp van deze aanpak met een failure rate nadert nul.
Eenmaal thij muizen zijn klaar om te worden geofferd, de gewonde of kanker longen kan dan worden verwijderd voor histologische en pathologische analyse. Echter, om goed gekwantificeerd histologische variabelen voor vergelijking met andere longen, is het essentieel om de fixatie te standaardiseren en de vaste longvolume 10 goed te kwantificeren. Dit document beschrijft in detail de eenvoudige procedures die gestandaardiseerde fixatie alsmede een manier om de vaste longvolume te meten toelaten. Het volume is een essentieel gegeven in de kwantificering van de histologie, omdat zonder zo'n volumebepaling, alleen relatieve dichtheden worden gemeten 10. Zodra het longvolume is echter bekend absolute metingen van cellen en andere structurele metingen in de longen kan dan worden gekwantificeerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven procedures hebben een aantal voordelen. Eerst de benodigde apparatuur is eenvoudig en goedkoop. Ten tweede kan de intubatie snel worden uitgevoerd met weinig fouten. Ten derde, het vermogen naar de longen vaste longvolume vast op een constante druk, en meet maakt kwantificering van structuren of cellen in de long 10.
Een mogelijk nadeel van de intubatie is de kleine chirurgie. Dit kan de mogelijkheid om de procedure te herhalen als een 2de instillatie…
Materials
| Laboratory Balance | Ohaus | Adventurer Pro Model AV 313 | Other balances can be used if they have a range of 1 – 300g |
| 20 g Luer intravenous catheter | Insylte | Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva | |
| 500 mL laboratory bottle | Various | Several other possible vendors |
Referências
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice. Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory. 41, 128-135 (2007).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab animal. 35, 39-42 (2006).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D. Direct Laryngoscopy in Mice. Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601 (2013).
- Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).
- Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives. Proc Am Thorac Soc. 3, A549 (2006).
- Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. In vivo measurement of lung volumes in mice. Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).
