בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

Summary

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Abstract

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Introduction

האנדותל של כלי הדם הוא לא רק שכבת מחסום שמפרידה דם ורקמות, זה נחשב בלוטת אנדוקרינית עצומה המשתרעת על עץ כלי הדם כולו עם שטח פנים של 400 מ"ר ^1. את רווחתם של האנדותל חיוני הומאוסטזיס וסקולרית. האנדותל מתפקדת משתתף והפרעות שונות לב וכלי דם, כולל טרשת עורקים, וסקוליטיס ופציעות איסכמיה / reperfusion, וכו ^'2-4. נכון להיום, את המנגנונים תאיים ומולקולריים הספציפיים המעורבים הגדרות מחלות אלה אינם מובנים היטב בשל אופי אנטומיים המתפזר של האנדותל.

העכבר הוא מודל חשוב למחקר כי טכניקות מניפולציה גנטיות הן יותר התפתחו בעכברים מאשר בכל מיני יונקים אחרים. עם זאת, את הבידוד של תאי אנדותל אב עורקים בעכברים העיקריים נחשב קשה במיוחד בגלל גודלו הקטן של אב העורקים עושה enzymatעיכול ic של האנדותל מעשי. חלקם דיווחו נהלים לבודדים ולטהר ECS דורשות ^5-7.

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בשיטה פשוטה כדי לבודד להרחיב בתאי האנדותל מן האאורטה העכבר ללא שימוש בכל ציוד מיוחד. בפרוטוקול זה, האאורטה המבודד הטרי נחתך למקטעים קטנים זורע על מטריצה ​​עם האנדותל פונה כלפי מטה על מנת לאפשר הנבטה האנדותל. לאחר המגזרים יוסרו, תאי אנדותל מורחבים במדיום האנדותל מועדף והם מוכנים לניסויים אחרי שניים או שלושה קטעים. היתרונות של השיטה המתוארת הם כי: 1) מספרים גבוהים באופן משמעותי של תאי אנדותל נקצרים מן האאורטה יחיד; 2) כדאיות התא נשמר היטב; ו -3) לא נדרש ציוד או טכניקה מיוחדת. הוא מספק אמצעי יעיל לזיהוי מנגנונים תאיים ומולקולריים ספציפיים פתופיזיולוגיה תא האנדותל. לאלו המעוניינים ללמוד יחסי ציבורimary בתרבית תאי אנדותל מעכברי נוק-אאוט או גן, גן עקום בעכברים, או מודל מחלה בעכברים, פרוטוקול זה הוא מאוד שימושי וקל לתרגל.

Protocol

1. ניתוק של אבי העורקים מעכברים כל הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש של וויין סטייט. שים את העכבר לתוך תא האינדוקציה של מכונת ההרדמה. הגדר את ז…

Representative Results

הנבטת תא האנדותל תא האנדותל ספונטני נברא נכתב ממקטע עכבר אב עורקים. מגזר האאורטה העכבר היה מותר לגדל על מטריצה-מופחת גורם גדילה אז במדיום גידול תא האנדותל במשך 4 ימים. נביטת תא האנדותל מופיעה בדרך כלל 2 – 4 ימים. Photomicrographs נל…

Discussion

מחקר זה מדגים שיטה פשוטה לבודדים תאי התרבות האנדותל מתוך האאורטה עכבר בלי שום ציוד מיוחד. מכתים immunofluorescence הצביע על כך שרוב התאים היו תאי אנדותל לאחר הקטע השני. הוא הציע כי תאים ב שני למעבר שלישי מתאימים במבחנה בניסויי vivo ללמוד ביולוגיה האנדותל.

<p class="jove_conte…

Materials

4- or 6-week-old mice (Jackson Laboratory, #000664).

Sterile 1X phosphate-buffered saline (PBS, Gibco, #10010-023).

Sterile 1X PBS containing 1,000 U/ml of heparin (Sigma Aldrich, H3149).

Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium[DMEM] with 25mM HEPES[Gibco, #12320-032 ], supplemented with 100μg/ml endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma,#2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/ml heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000U/ml penicillin and 10mg/ml streptomycin [Gibco, #15140-122]).

Growth factor reduced matrix (BD Biosciences, #356231).

Neutral proteinase (Dispase, 1U/ml, Fisher Scientific #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034g/L[Sigma, #1255], in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose[Gibco, #12320-032 ]).

Gelatin (100‑200 μg/cm2, Sigma, #G1393).

1,1`-dioctadecyl-3,3,3`,3`- tetramethylindo- carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL, Life Technologies, #L3484),  FITC-labeled Ulex europeus agglutinin (Ulex-Lectin, Sigma, #L9006),  Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody (BD Biosciences, # 553372).

Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody (Cell signaling, #9698), anti-mouse endothelial nitric oxide synthase (Abcam, #ab5589), anti-mouse vascular endothelium-cadherin (Abcam, #33168), anti-mouse calponin (Abcam, #700), FITC-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma, #F6005)

One ml syringe fitted with 25-G needle (Fisher Scientific, #50-900-04222).

100mm Peri dishes (Fisher Scientific,  #07-202-516).

Six-well cell culture plates (Fisher Scientific, #08-772-1B).

T12.5 cultuer flask (Fisher Scientific, #50-202-076)

Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade (Fine Science Tools, Inc)

Anesthesia machine with isoflurane (Webster Veterianary Supply, #07-806-3204), heating lamp

Centrifuge machine.

Inverted phase-contrast microscope.

inverted fluorescence microscope.