Инженерная 3D Шелковый коллагена на основе модели поляризованного нервной ткани

Summary

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Abstract

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Introduction

Центральная нервная система (ЦНС) могут быть затронуты различными нарушениями, связанных с сосудистой, структурные, функциональные, инфекционный или дегенеративный. По оценкам 6,8 млн человек ежегодно умирают в результате неврологических расстройств, что представляет собой растущую социально-экономическое бремя во всем мире ^1. Тем не менее, лишь немногие из нарушений есть доступные процедуры. Таким образом, существует острая необходимость в инновационных терапевтических стратегий для пациентов, страдающих от неврологических расстройств. К сожалению, многие ЦНС целевые терапевтические неудачу в ходе клинических испытаний, в частности, из-за использования неадекватных доклинических исследований моделей, которые не позволяют оценить острых и хронических воздействий с физиологически соответствующих функциональных показаний.

Несмотря на значительные усилия исследования в течение последних десятилетий, есть огромное количество неизвестно о структуре и функции ЦНС. Для того, чтобы получить больше знаний, модели животных часто намред модели патологических состояний, таких как травмы головного мозга травматического (TBI) или слабоумия, особенно в доклинических исследованиях. Тем не менее, животные существенно отличаются от людей как в анатомии ЦНС, а также в функции, экспрессии генов и метаболизма ^2-4. С другой стороны, 2D культур в пробирке являются распространенным методом для исследования клеточной биологии и которые обычно используются для открытия новых лекарств. Однако культуры клеток 2D хватает сложность и физиологическое значение по сравнению с человеческим мозгом ^5-7. Хотя не является заменой для низкой стоимости и простоты 2D исследований на клеточных культурах или сложности, предоставленной на животных моделях, 3D тканевой инженерии может генерировать усовершенствованные исследовательские модели, чтобы закрыть разрыв, который существует между 2D в пробирке и в естественных подходов. 3D тканевой инженерии обеспечивает более физиологически соответствующие экспериментальные условия, достигнутые 3D межклеточных взаимодействий и внеклеточных сигналов, предусмотренных биоматериала лесов. DespITE значительное доказательство за стоимости 3D культур, в настоящее время существует лишь несколько моделей ткани 3D ЦНС, таких как стволовые клетки получены Органоид культур ^8-10, neurospheroids ¹¹ и диспергируют гидрогеля культуры ^12,13. Перспективные технические методы, включая многослойной литографии ^14, и 3D-печати ¹⁵ были использованы для изучения легких, печени, почек и ткани. Тем не менее, есть отсутствие моделей 3D ЦНС, которые позволяют на секции роста нейронов, таких как имитируя корковой архитектуру и биологию. Отдельно рост нейритов из нейрональных клеток органов ранее продемонстрировано в 2D культур с помощью микрообработки ^16,17 позволяя изучение трассировки аксонов тракта, притока кальция, сетевой архитектуры и деятельности. Эта идея вдохновила нас к разработке 3D поляризованного нервной ткани, где сотовые органы и аксонов массивы, расположенные в разных отсеках имитируя многоуровневую архитектуру мозга ¹⁸ </sup>. Наш подход основан на использовании уникального дизайна шелковой лесов который вмещает высокую плотность клеток в ограниченном объеме и позволяет разрастание плотной аксонов сети в коллагеновый гель. Здесь мы демонстрируем полную процедуру сборки головного мозга, как ткани, включая изготовление лесов и нейронов культуры.

Protocol

Протокол изоляции ткани мозга была одобрена Institutional Комитета по уходу и использованию животных Университета Тафтса по и соответствует Национальных Институтов Здоровья Руководства по уходу и использованию лабораторных животных (Institutional Animal Care и использования комитета B2011-45). 1. Подготовка Шелковый леса Подготовка раствора из шелка тутовый шелкопряд коконов, как описано ранее 19,20. Разрежьте каждый кокон на 8 равных частей с помощью ножниц. Используйте около 11 коконов в течение 5 г фрагментированных коконов. (15 мин) Подготовьте 2 л 0,02 М Na 2 CO 3 раствором и довести его до кипения, используя горячую плиту. (15 мин) Взвесьте 5 г фрагментированных коконов и варить их в Na 2 CO 3 раствором в течение 30 мин. Движение кипящей шелковые каждую пару минут с помощью шпателя. Этот шаг, называемый также де-гуммирование, очищает фиброин шелка из гидрофильных белков, sericins. (30 мин) <lя> Отожмите фиброин от руки и промойте его в дистиллированной воде, по крайней мере три раза, чтобы промыть все оставшиеся серицин и химических веществ. (5 мин) Поместите влажный фиброин на чашку Петри и высушить экстракт фиброина в капот потока O / N. На следующий день взвешивают сухой массы фиброина и поместите фиброин в стеклянном стакане. (15 мин) Для того, чтобы растворить фиброин в 9,3 М растворе LiBr, рассчитать необходимый объем (в мл) LiBr путем умножения массы сухого фиброина на 4. Медленно залить LiBr раствора над шелковой фиброина и погружают все фиброина волокон с помощью шпателя. Накройте стакан для предотвращения испарения и поместить его при 60 ° С в течение 4 ч, чтобы позволить волокна, чтобы растворить. (15 мин) Использование шприца, собирать фиброина решение от стакана и загрузить его в MWCO 3500 диализных кассетах. Выполнение диализ против дистиллированной воды в течение 48 ч. Меняйте воду каждые два часа. Использование шприца, собирать фиброина решение откассеты в 50 мл конические пробирки и центрифугируют дважды при 9000 оборотах в минуту (~ 12700 х г) при 4 ° С в течение 20 мин. Налейте надосадочную жидкость в новую пробирку после каждого шага центрифугирования и отбросить гранул. (40 мин) Измерение концентрации фиброина путем оценки сухого веса. Залить 1 мл раствора шелка в весовой лодке. Сушат образца в печи при 60 ° С в течение 2 ч. Взвесить сухой фиброин шелка и расчета концентрации шелка фиброина раствора путем умножения полученного вес 100. ожидаемую концентрационную шелка раствора 6-9% (вес / объем). Регулировка концентрации шелка до 6% (вес / объем) разбавлением дистиллированной водой. Остановка точка: жидкость шелк фиброина можно хранить при 4 ° С в течение одного месяца в закрытом контейнере. Подготовка пористых каркасов из шелка решения. Сито гранулированного NaCl, чтобы отделить гранулы размером 500-600 мкм, который будет использоваться на последующих этапах. Откажитесь от гранулс размером менее 500 мкм и выше 600 мкм. (15 мин) Налейте 30 мл 6% раствора шелка в политетрафторэтилена (ПТФЭ) формы (Рисунок 1). Аккуратно рассеивают 60 г просеянной NaCl над шелка. Нажмите контейнер, чтобы получить однородный слой соли. Инкубируют 48 ч при комнатной температуре для полимеризации шелк. Поместите строительных лесов, содержащего ПТФЭ форму в печи при 60 ° С в течение 1 часа, чтобы завершить полимеризацию и испарить оставшуюся жидкость. Поместите содержание ПТФЭ плесени в химический стакан, содержащий 2 л дистиллированной воды в течение 48 ч, чтобы выщелачивание соли. Менять воду 2-3 раза в день. Извлеките губку каркасов из форм, когда соль полностью вымывается точки остановки:. Губки могут быть сохранены погружают в воду при 4 ° С в закрытом контейнере, чтобы предотвратить каркасов от обезвоживания. Когда все будет готово, вырезать подмости с 5 мм диаметром биопсии удар. Нарезанные каркасов для достижения около 2 мм в высоту. ПуNCH ​​из центра на эшафот с 2 мм биопсии удар диаметр (рис 2А). (1 час) Автоклав каркасов погружают в воду, чтобы стерилизовать их (мокрый цикл, 121 ° C, 20 минут) Остановка точку:. Губки могут быть сохранены погружают в воду при 4 ° С в закрытом контейнере, чтобы предотвратить каркасов от обезвоживания. Перед запланированной посева клеток, погружают каркасов в стерильной 0,1 мг / мл поли-D-лизином раствора (PDL). Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С. Промыть 3 раза каркасы с фосфатным буферным раствором (PBS), чтобы удалить не связанный PDL. (30 мин) 2. Выделение Крыса корковых нейронов Проанализируйте кору из эмбриональных день 18 (E18) Спрэг Dawley крыс, как описано ранее Пачифичи и Перуцци 27 после утвержденного протокола животное получается. (2 ч) Инкубируют 10 кору в 5 мл 0,25% трипсина с 0,3% ДНКазы I (от поджелудочной железы быка) в течение 20 мин при 37 ° С. Инактивации трипсина, добавив равный объем 1 мг / мл соевого белка. Растирают кору, используя 10 мл пипетки Пастера от пипетки вверх и вниз 20 раз, пока один клеточной суспензии не генерируется. Будьте нежны и избежать образования пузырьков воздуха. (10 мин) Центрифуга клеточной суспензии в 127 мкг в течение 5 мин. Повторное приостановить осадок клеток в 10 мл культуральной среды (Neurobasal среднего, 1x B27 добавки, 1x Glutamax, 1% пенициллина / стрептомицина). Граф клеток. Ожидаемый концентрации клеток примерно 2х10 7 / мл. (20 мин) 3. Построить Ассамблею и культура Леса посев с клетками. Перемещение стерильные каркасов и все необходимые столовые приборы внутри капот культуре клеток. Использование стерильного пинцета поместить каркасы в клеточной культуре 96-луночного планшета выделении одного каркас на лунку. (10 мин) Погрузитесь каркасов в среде для культивирования клеток, чтобы уравновесить их до клеток семениIng. Инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С. (10 мин) Аспирируйте избыток среды от лесов. Применить 100 мкл клеточной суспензии / эшафот. (10 мин) Инкубируйте клетки при 37 ° CO / N, чтобы для прикрепления клеток к плахе. На следующее утро аспирации непривязанными клетки и применить 200 мкл / лунку свежую культуральную среду. (10 мин) Строительные леса встраивания с коллагеновой матрицы. (2 ч) Поместите 10x PBS, водой, 1 N NaOH и хвоста крысы коллагена на льду. Подготовка рабочего раствора коллагена в соответствии с инструкциями производителя. Поддержание на льду до конструкты клеток-затравку не готовы (до 1 ч). Удалить клеточные семенами шелковые конструкции из инкубатора и аспирата избыток среды. Использование стерильного пинцета передачи каркасов на пустые лунки на пластину погружают а каждый и каркас в 100 мкл 3 мг / мл раствора коллагена. Поместите планшета для культуры ткани обратнов инкубаторе в течение 30 мин, чтобы позволить полимеризации коллагена. Применить 100 мкл подогретого клеточной культуральной среды / лунку. Культура конструкты в течение одной недели замены среды ежедневно путем замены только половину объема среды. 4. Анализ микроскопии Live / мертвых окрашивания (1 час) Подготовка исходного раствора пропидийиодидом (PI) 1 мг / мл (1,5 мМ) в дистиллированной воде. Подготовка исходного раствора флуоресцеина диацетата (FDA) 2 мг / мл в ацетоне. Подготовить рабочий раствор, содержащий 10 мкМ PI и 0,15 мкМ FDA разбавленный в PBS. Предварительно нагреть раствор до 37 ° С на водяной бане. Вымойте клеток с подогретого PBS, чтобы удалить сывороточные эстеразы. Аспирируйте PBS. Нанесите подогретого рабочего раствора на клетки в течение 2 мин и промойте его PBS. Используйте эпифлуоресцентной микроскопа изображение клетки (ПИ экс λ = 490 нм, λ = EM 570 нм; FDA экс Л = 490 Нм, ет λ = 514 нм). Пятно остается стабильным в течение 40 мин. Длительное окрашивание может привести к неспецифической окрашивания в результате поглощения PI клетками и со-локализации ИП / FDA в клетках. Иммуноокрашивание В заданное время точки культуры фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида (PFA) в течение 30 мин при комнатной температуре. Из-за токсичности PFA дымит шаг крепления должны быть выполнены в химической вытяжкой. Промыть каркасов с 3x PBS точки остановки:. ПФА-фиксированные конструкции могут быть сохранены в PBS при 4 ° С в течение нескольких дней, прежде чем приступить дальнейших шагов. Инкубируйте каркасов в 0,2% Triton, 0,25% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS, содержащие первичное антитело O / N при 4 ° С. На следующий день отказаться от окрашивания раствор и промыть Леса 3 х 30 мин с PBS для удаления несвязанного первичного антитела. Инкубируйте образцы с вторичным антителом, разведенным в 0,2% Тритон, 0,25% BSA в PBS в течение 2ч при комнатной температуре. Удалить окрашивания раствор и промыть Леса 3 х 30 мин с PBS для удаления несвязанного вторичного антитела. Изображение каркасы, использующие конфокальной микроскопии с 20X цели, принимая 100 мкм Z-секции образца с 1 мкм шагом. Для визуализации тонких нейриты разрешение изображения должно быть минимальной 1,024 х 1,024 пикселей. РНК, ДНК и белка изоляция Примечание: РНК, ДНК и выделение протеина, использу коммерческий AllPrep ДНК / РНК / белок Mini Kit в соответствии с инструкциями производителя. Использование стерильного пинцета передачи каркасов из культурального планшета в 2 мл стерильной пробирке. Разместите один эшафот за трубку. Добавить 200 мкл буфера RLT в каждую пробирку. Лишить конструкцию фрагментируя его стерильными microscissors. Для гомогенизации нарушенную ткань, передавать содержимое тубы на ротационную колонку. Спин в течение 2 мин на полной скорости в микроцентрифуге.Лизат гомогенизируют, как она проходит через ротационную колонку. Собирают поток через и использовать его немедленно выделения РНК, ДНК и белка в соответствии с протоколом производителя. Количественно выход нуклеиновых кислот любой другой совместимый метод (например, NanoDrop). Количественная выход белка, используя BCA анализа белка в соответствии с инструкциями изготовителя. Измерьте результаты анализа с помощью планшетного на длине волны 562 нм. Примечание: Ожидаемый выход нуклеиновых кислот и белка в конструкции по отношению к плотности клеток, показан на рисунке 4.

Representative Results

Твердые шелковые губки нарезанные по форме пончика, представляют собой уникальную и простую идею, чтобы достичь разобщенным архитектуру, напоминающую нервной ткани (рис 2а). Высоко пористая структура помост с размером пор 500 мкм приводит к исключительно высокой площадью поверхности, позволяющих посев и рост высокой плотности клеток в малом объеме (2×10 7 / мл) (2В). Кроме того, высокая пористость эшафот позволяет для неограниченного распространения питательных веществ и отходов, образующихся в превосходной жизнеспособности плотных клеточных культур в течение длительного времени кадров. После посева нейроны быстро и равномерно прикрепить к поверхности каркасных порах. После прикрепления клеток является полным и клетки уравновешивали в шелковой подложке, губка каркас заполняется мягкой коллагеновой матрицы, чтобы обеспечить среду для 3D аксонов формирования сети (рис 3 </strong>). При отсутствии в коллагеновой матрице Компартментализация аксонов и клеточных тел невозможно, так как нейроны растут расширения только на поверхности пор в результате смешанных сетей, как обнаружено с 2D поверхностей (фигура 3В). В противоположность этому, коллагеновый гель обеспечивает сетчатую структуру, которая поддерживает обширный аксонный отросток в 3D, а нейронные клеточные тела остаются прикрепленными к шелковой помост (рис 3C). Эта модель роста приводит к разобщенности клеток органов и чистых аксонов сетей (рис 3D), который напоминает серого и белого вещества коры головного мозга. Помимо микроскопии, конструкции могут быть оценены с различными другими методами 18, в зависимости от вопроса за эксперимента. Например, выделение ДНК, РНК и белка из конструкций может быть легко выполнена с использованием коммерческих наборов (рисунок 4). Выход нуклеиновых кислот и белков PEг конструкция зависит от количества клеток изначально посеянных на шелковых каркасов. Чем больше клеток высевали тем выше выход ДНК, РНК и белка. Рисунок 1. ПТФЭ формы используются для приготовления шелк губка лесов Размеры:.. 10 см в диаметре, 2 см высота Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. 3D мозга, как модель ткани. (А) пористого шелк губка эшафот. (Б) Live / мертвых окрашивания нейронов в 1 день на посев на шелковой эшафот, прежде чем коллаген встраивания (зеленый-живых клеток, красных мертвые клетки). Панели на правой стороне показать маgnification площади захваченного в красных рамках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3. нейронов разобщенным вырост в 3D-модели мозга, как ткани (A) Леса отсеков:. Кузовом купе красных клеток, Blue-купе аксонов. (Б) нейронов модель роста в 1-й день после посева до коллагена вложения. (С). Нейронов вырост на 7 день после посева в теле клетки отсека. (D) нейронов вырост на 7 день после посева в аксонов отсеке. Зеленый -. ΒIIITubulin Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этогофигура. Рисунок 4. Ожидаемые выход (A) РНК и ДНК, и (б) белка в конструкции по отношению к количеству клеток, посеянных на эшафот (± SD, п = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,

Discussion

Here we described the guidelines to assemble a compartmentalized 3D brain-like tissue model. The model is characterized by dense polarized culture of neurons resulting in the development of two morphologically different compartments: one containing densely packed cell bodies, second containing pure axonal networks. Overall, the scaffold architecture and growth pattern mimic brain cortical tissue including the six laminar layers and white matter tracts²¹.

The donut-shaped silk protein-based tissue model allows for modifications and tuning of mechanical properties, versatile structural forms, hydrogel fillers and cellular components. Thus, this tissue model establishes a base platform for a wide range of studies. Silk is a favorable candidate for biomaterial platforms due to its biocompatibility, aqueous-based processing, and robust mechanical and degradation properties²². The silk matrix also serves as a stable anchor to reduce collagen gel contraction over time in culture. The properties such as silk concentration and porosity of the scaffold used in this model have been previously adjusted to achieve optimal cell growth and mechanical properties resulting in brain-like tissue elasticity^18,23,24. We suggest to keep these parameters constant to ensure the successful outcome and reproducibility of the experiments.

The 3D neuronal network formation was achieved by combining two types of biomaterials with different mechanical properties: a stiff scaffold to provide neuronal anchoring and a softer gel matrix to permit axon penetration and connectivity in 3D. Selective material preferences of the silk scaffold and soft hydrogel provide the underlying principle for compartmentalizing the neurons from the axonal connections. Due to the inert nature of the silk scaffold, functionalization with poly-D-lysine is required for neuronal attachment. However, other cell adhesion promoting factors can be applied such as RGD²⁵ or fibronectin²⁶. To achieve the 3D network formation the silk scaffold needs to be filled with hydrogel in a timely manner as soon as neurons are attached to the scaffold. Likewise, the collagen matrix filler can be replaced by other hydrogels, thus allowing the study of the influence of 3D extracellular environments on axonal network formation to serve as a platform to evaluate novel hydrogels in terms of neuronal compatibility. Additionally, apart from rat cortical neurons other neuronal sources such as hippocampal neurons or induced pluripotent cell (iPSc)-derived neurons can be utilized. Moreover, the tissue model can be used to study heterocellular interactions by including glial cells along with neurons and to build more complex brain-like tissue.

As shown previously, our model can be utilized to evaluate neuronal functionality in 3D microenvironment with a variety of assays such as cell viability, gene expression, LC-MS/MS and electrophysiology, thus demonstrating physiological relevance of the model¹⁸. Other methods, which are frequently utilized to evaluate 3D tissue-engineered constructs, such as immunostaining and microscopy^8,9,11 can also be used to assess cell distribution and extent of axonal network formation. However, it has to be noted, that due to the high density of the collagen matrix, the penetration of antibodies and depth of the imaging is limited to few hundred micrometers. Moreover, the signal to noise ratio may be affected by nonspecific background fluorescence. This can be overcome by using lipophilic cell tracers and genetically expressed fluorescent proteins which diminish the need for immunostaining¹¹. Alternatively, the imaging can be performed with 2-photon microscopy instead of usual one-photon technique, which may reduce the signal loss, photobleaching, and can be extended to several hundred micrometers of depth.

Summarizing, the silk and collagen-based brain-like tissue offers a robust platform to study neuronal networks in 3D and is a starting point for the development of more advanced models of neurological disorders in the future. Independent from the mode of evaluation, the relative simplicity of this tissue model supports its utility, success and reproducibility.

Materials

Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530	–
LiBr	Sigma-Aldrich	213225	–
MWCO 3500 dialysis cassettes	Thermo Fisher	66110	–
Heating plate	Fisher Scientific	Isotemp	–
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	–	–
Sieve	Fisher Scientific	–	No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold	–	–	made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl	Sigma-Aldrich	71382	–
Biopsy Punch 5mm	World Precision Instrument	501909	–
Biopsy Punch 2mm	World Precision Instrument	501908	–
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	final concentration 10 ug/ml, dissolved in water
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML	–
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049-500ML	–
DNase	Roche	10104159001	final concentration 0.3%
Soybean protein	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium	Gibco	21103049	warm up to 37°C before use
B27 supplement 50x	Gibco	17504-044	–
Glutamax	Gibco	35050-061	–
Penicilin Streptomycin	Corning	30-002-CI	–
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	final concentration 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosive
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170-10MG	toxic
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378-5G	–
Olympus MVX10	Olympus	–	–
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G	–
anti-βIIITubulin antibody	Sigma-Aldrich	T2200	rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546	Molecular Probes	A11010	goat 1:250
goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-5ML	–
Leica SP2 confocal microscope	Leica	–	objective 20x
QIAshredder	Qiagen	79654	–
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit	Qiagen	80004	–
Ethyl alcohol, Pure	Sigma-Aldrich	E7023	–
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	–	–
BCA protein assay	Thermo Scientific	23225	–
Plate reader Spectramax M2	Molecular Devices	–	absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	TedPella	1346	–