Geçici Serebral Hipoksi-iskemi Dayalı Bir Trombotik İnme Modeli
Summary
Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.
Abstract
İnme araştırması klinik uygulamaya nöroprotektif tedavilerin tercüme birçok aksiliklere dayandı. Buna karşılık, gerçek dünya tedavisi (tPA trombolitik) nadiren preklinik inme araştırma hakim mekanik tıkanıklığı tabanlı deneysel modellerde faydaları üretir. Tezgah ve Yatağımın arasındaki bu bölünme klinik öncesi inme araştırma tPA-duyarlı modeller istihdam ihtiyacını göstermektedir. Bu amaçla, basit ve tPA-reaktif trombotik inme modeli icat burada tarif edilmektedir. 37.5 ± 0.5 ° C 'de, hayvan, rektal sıcaklık muhafaza edilirken bu model, 30 dakika boyunca, yetişkin farelerde bir yüz maskesi vasıtasıyla tek taraflı karotis ve% 7.5 oksijen teslimat geçici oklüzyonu meydana gelir. Tek taraflı karotis arter veya hipoksi geri dönüşümlü ligasyonu her biri sadece geçici serebral kan akımı bastırılmış olsa da, her iki hakaret kombinasyonu reperfüzyon açıkları, fibrin ve trombosit birikimi ve büyük infar kalıcı nedenorta serebral arter tarafından sağlanan bölgede ct. Önemli olarak, kuyruk ven 0.5, 1, ya da 4 saat sonra-Thi (10 mg / kg) yeniden birleştirici tPA enjeksiyonunu bir ölüm oranı ve enfarkt boyutunun zamana bağımlı bir azalma sağladı. Bu yeni model, inme basit ve deney sonuçlarını karşılaştırmak için laboratuvarlar arasında standardize edilebilir. Bundan başka, bu kraniektomi ya da önceden-oluşturulmuş emboli yol açmadan tromboz indükler. Bu eşsiz yararları göz önüne alındığında, THI modeli klinik öncesi inme araştırma repertuvarına bir kullanışlı bir ektir.
Introduction
Tromboliz ve rekanalizasyonun klinik pratikte 1 akut iskemik inme en etkili tedavidir. Oysa, klinik öncesi araştırma nöro çoğunluğu damar tıkanıklığı çıkarılması üzerine serebral kan akımının hızlı iyileşme üreten ve tPA lizisle hiçbir fayda az gösteren bir geçici mekanik tıkanıklık modeli (lümen dikiş orta serebral arter tıkanıklığı) uygulandı. Inme modelini şüpheli seçimi hastanın 2,3 için nöro-koruyucu tedavisi çeviri zorluk, en azından kısmen, katkıda bulunduğu öne sürülmüştür. Bu nedenle, klinik öncesi araştırma tPA duyarlı tromboembolik inme modelleri istihdam için artan bir çağrı var, ama bu tür modelleri de teknik sorunlar (Tartışma) 4-7 var. Burada tek taraflı geçici hipoksik-iskemik (ti) hakaret ve intravenöz tPA tedavisine 8 yanıtları dayalı yeni bir trombotik inme modeli açıklar.
Thi inme modeli 1960 9 yetişkin sıçan deneyleri için icat edilmiştir Levine prosedürü (bir odasında geçici hipoksi maruz kalma ve ardından tek taraflı karotis arter kalıcı ligasyonu) dayalı olarak geliştirilmiştir. Orijinal Levine prosedürü karanlığa gömüldüğü, çünkü sadece değişken beyin hasarı üretti, fakat 1981 10 neonatal hipoksik-iskemik ensefalopati (HİE) bir model olarak Robert Vannucci ve arkadaşları tarafından yeniden tanıtıldı aynı hakaret kemirgen yavrular tutarlı nevropatolojisi neden oldu. Son yıllarda, bazı Araştırmacılar hipoksik odasına 11 sıcaklığı ayarlayarak yetişkin farelere Levine-Vannucci modeli adapte yeniden. Orijinal Levine prosedüründe tutarsız beyin lezyonları hipoksik odasında yetişkin kemirgenler vücut sıcaklıklarını dalgalanan doğabilecek düşünülebilir. Bu hipotezi test etmek için, hipoksik gaz verilerek Levine prosedürünü modifiyeBir yüz maskesi vasıtasıyla, ameliyat masasına 12, 37 ° C'de, kemirgen temel sıcaklık muhafaza edilirken. Beklendiği gibi, katı vücut ısısı kontrolü büyük ölçüde HI-kaynaklı beyin patolojisi tekrarlanabilirliği artmıştır. HI hakaret de pıhtılaşmayı, Otofaji ve gri-beyaz-madde hasarı 13 tetikler. Diğer araştırmacılar da inme sonrası inflamatuar yanıtlar 14 araştırmak için HI modeli kullandık.
HI inme modelinin benzersiz bir özelliği de yakından kan akımı, endotel hasarı (örn nedeniyle HI-kaynaklı oksidatif strese) ve hiperkoagübilite (HI-indüklenen platelet aktivasyonu) staz dahil trombüs oluşumu Virchow'un üçlü, (aşağıda olduğunu Şekil 1A) 15. Bu nedenle, HI modeli gerçek dünya iskemik inme ile ilgili bazı patofizyolojik mekanizmaları yakalayabilir. Bu düşünceyle, biz daha un tersine çevrilebilir ligasyonu ile HI modeli rafineilateral karotis arter (dolayısıyla geçici HI hakaret oluşturmak için), ve ya Edaravone olmadan tPA trombolitik onun yanıtları test edilmiştir. Edaravone zaten başlangıç 9 24 saat içinde iskemik inme tedavisinde Japonya'da onaylanmış serbest radikal temizleyicisidir. Bizim deneyler kadar kısa 30 dakika kadar geçici HI trombotik enfarktüs tetikler gösterdi ve bu kombine tPA-Edaravone tedavi sinerjik faydalar 8 bahşeder. Burada detaylı cerrahi girişimler ve akut iskemik inme reperfüzyon tedavileri optimize etmek için kullanılabilecek Thi modelinin metodolojik hususlar, açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnme bir yaşlanma nüfusa sahip herhangi bir toplum için önemi giderek artan önemli bir sağlık sorunudur. Küresel olarak, inme, tüm ölümlerin 18% 11,1 eşdeğer 2010 yılında tahmini 5,9 milyon ölümcül olaylar ile ikinci ölüm önde gelen nedenidir. İnme da sakatlığa ayarlanmış yaşam yıllık üçüncü önde gelen nedenidir (DALY) 1990, 19 beşinci pozisyona yükselen, 2010 yılında küresel kaybetti. Bu epidemiyolojik veriler akut (iskemik) inme daha etkili tedavilerin ihti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the NIH grant NS074559 (to C. K.). We thank all collaborators who contributed to our research articles that the present methodology report is based upon.
Materials
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~13 weeks old (22~30 g) |
| Mobile Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901807 | anesthesia |
| Medical air (Compressed) air tank | Airgas | UN1002 | anesthesia |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-25 | anesthesia |
| Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem | Surgivet | V703501 | hypoxia system |
| 7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank | Airgas | UN1956 | hypoxia system |
| Temperature Controller with heating lamp | Cole Parmer | EW-89000-10 | temperature controllers |
| Rectal probe | Cole Parmer | NCI-00141PG | temperature controllers |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mannitol | Sigma | M4125 | in-vivo TTC |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | in-vivo TTC |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | brain section for in-vivo TTC |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | whole-braina imaging |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Cryostat | Vibratome | ultrapro 5000 | brain section for IHC |
| Evans blue | Sigma | E2129 | Detecting vascular perfusion |
| Microtome | Electron Microscopy Sciences | 5000 | brain section for histology |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Fluorescent microscope | Olympus | DP73 |
Referências
- Broderick, J. P., Hacke, W. Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies. Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).
- Hossmann, K. A. Pathophysiological basis of translational stroke research. Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Macrae, I. M. Preclinical stroke research–advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia. Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).
- Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke. Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations. J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9, e98807 (2014).
- Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).
- Rice, J. E. 3. r. d., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).
- Adhami, F., et al. Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy. Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).
- Shereen, A., et al. Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).
- Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).
- Zoppo, G. J. Virchow’s triad: the vascular basis of cerebral injury. Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).
- Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
- Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
- Dirnagl, U., Macleod, M. R. Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice. Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- Khatri, P., et al. Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I. Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-bed–specific hemostasis and hypercoagulable states. New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
