Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

Summary

De novo a lipogênese e oxidação do ácido β-gordo constituem vias metabólicas importantes em hepatócitos, caminhos que são perturbados em vários distúrbios metabólicos, incluindo a doença de fígado gordo. Aqui demonstramos isolamento de hepatócitos primários de rato e descrever quantificação da oxidação de ácidos graxos e β-lipogênese.

Abstract

O metabolismo lipídico no fígado é complexo. Além de importar e exportar lipídios por meio de lipoproteínas, os hepatócitos podem oxidar lipídios por meio da oxidação de ácidos graxos ou, alternativamente, sintetizar novos lipídios por meio da lipogênese de novo. A soma líquida dessas vias é ditada por uma série de fatores, que em certos estados de doença levam à doença hepática gordurosa. O acúmulo excessivo de lipídios hepáticos está associado à resistência à insulina de todo o corpo e à doença cardíaca coronária. Ferramentas para estudar o metabolismo lipídico em hepatócitos são úteis para entender o papel do metabolismo lipídico hepático em certos distúrbios metabólicos.

No fígado, os hepatócitos regulam a quebra e a síntese de ácidos graxos por meio da oxidação β-gordurosa e da lipogênese de novo, respectivamente. A quantificação do metabolismo nessas vias fornece informações sobre o manuseio de lipídios hepáticos. Ao contrário da quantificação in vitro, usando hepatócitos primários, fazer medições in vivo é tecnicamente desafiador e consome muitos recursos. Portanto, quantificar a oxidação de ácidos graxos β e a lipogênese de novo em hepatócitos de camundongos cultivados fornece um método direto para avaliar o manuseio de lipídios de hepatócitos.

Aqui descrevemos um método para o isolamento de hepatócitos primários de camundongos e demonstramos a quantificação da oxidação de ácidos graxos β e lipogênese de novo, usando substratos radiomarcados.

Introduction

A doença hepática gordurosa não alcoólica é uma das principais causas de doença hepática em culturas ocidentalizadas^1,2. O acúmulo de lipídios no fígado está associado à morte celular, fibrose e insuficiência hepática por meio de mecanismos ainda desconhecidos^3-6. Na doença hepática gordurosa, a oxidação de ácidos graxos β mediada por hepatócitos e a lipogênese de novo são determinantes importantes do acúmulo líquido de lipídios^7,8. Este artigo irá, portanto, enfocar o isolamento de hepatócitos, seguido pela quantificação da oxidação de ácidos graxos β e lipogênese de novo.

Numerosas metodo....

Protocol

Todos experimentação animal deve ser realizado em conformidade com os regulamentos locais e federais e com a aprovação de uma IACUC e segurança de radiação administração institucional.

1. Preparação

1. Vários dias antes do ensaio, descongelar a garrafa de 500 ml de fígado Digest Médio (LDM) e recongelar ~ 35 ml de partes alíquotas em tubos cónicos de 50 ml. Armazenar a -20 ° C até serem necessárias.
2. Um dia antes do ensaio, pré-limpas esterilizar instrumentos de dissecação por autoclave.
3. No dia do ensaio, tratar a quantidade necessária de placas de cultura de 24 poços com colagénio.
   1. Misturar 1 parte de ....

Results

Isolamentos de hepatócitos normalmente resultam em 1 - 3 x ¹⁰ 7 células totais. Após incubação durante a noite, as células aparece hexagonal, muitos dos quais serão binucleadas (Figura 2). As células saudáveis ​​deve ser desprovido de granulações ou bolhas, que são indicativas de morte celular.

Em geral, o ensaio de oxidação de ácido gordo é executado em três a quatro réplicas por composto de teste. Conta para o CO _{2 amostras} são aproximadamente um quin.......

Discussion

O tempo de sacrifício para perfusão deve ser inferior a 3 minutos para perfusão ideal e digestão com colagenase do fígado. Uma vez que a perfusão com Perfusão Médio é iniciada, o fígado deve imediatamente alterar a aparência do vermelho ao pálido. Após aproximadamente 10 minutos de incubação com LDM, o fígado aparece inchado e rosa. No caso em que a perfusão é insuficiente, o fígado podem não exibir estas mudanças, e este será normalmente resultam num rendimento mais baixa de hepatócitos.

Ap.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tecnologias de Vida Média de Perfusão Hepática		17701038
Fígado Digest Tecnologias de Vida Média		17703034	Alíquota e armazene a -20 &graus; C
PBS	Corning	21-040-CV
10X DPBS	Corning	46-013-CM
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Life Technologies	26140079
Collagen	Life Technologies	A1048301
Sílica coloidal revestida com polivinilpirrolidona	GE Life Sciences	17-0891-01
Piruvato de Sódio	Cellgro	25-000-CI
Penicilina / Estreptomicina	Cellgro	30-001-CI
Insulina	Sigma	I0516-5ML
Dexametasona	Sigma	D2915-100MG
Albumina (BSA), Prato	de	Poços Fraction V MP Biomedicals
	Corning Falcon	353047
Tubulação Tygon S3	Cole Parmer	06460-34
Conectores de Trava de Leur Macho para 200 Barbs	Cole Parmer	45518-00
24 G x 3/4" Cateter	SurFlo	SROX2419CA
Perma-Hand Silk Suture	Ethicon	683G
Cell Strainer	Corning Falcon	08-771-2
IsoTemp 3013HD Recirculação Banho-maria	Fisher	13-874-3
Bomba Peristáltica MasterFlex C/L MasterFlex		HV-77122-24
Microclamp	Roboz	RS-7438	Pré-esterilizar em autoclave
5" Tesoura de operação reta e romba	Roboz	RS-6810	Pré-esterilizar em autoclave
Lâmina de 24 mm Tesoura de microdissecação reta e de ponta afiada	Roboz	RS-5912	Pré-esterilizar em autoclave
4" Pinça de microdissecação de ponta de 0,8 mm	Roboz	RS-5130	Pré-esterilizar em autoclave
4" Pinça de microdissecação de curva completa de ponta de 0,8 mm	Roboz	RS-5137	Pré-esterilizar em autoclave
Seringa de 60 ml	Becton Dickinson	309653
tubos cônicos de 50 ml Ensaio	BCA Corning Falcon	352070
	Thermo Scientific	23225
			biossegurança
CO2 Incubadora
Sorológica pipetas
1.000, 200, 20 μ l pipeta e dicas