Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
Feltet af regenerativ medicin og tissue engineering er hurtigt fremme, med gennembrud i tracheal og nyre regenerering to bemærkelsesværdige seneste resultater. De biomaterialer udviklet i tissue engineering bliver mere tilgængelige, med muligheder for at overføre sådanne protokoller til mindre specialiserede laboratorier. Et felt primet til gavn gennem øget brug af biomaterialer er in vitro diagnostik.
In vitro undersøgelser er en vigtig platform til at undersøge intracellulære signalveje inden enlige celletyper, og har hjulpet afgrænse mekanismerne bag mange sygdom patofysiologier. Disse undersøgelser generelt afhængige af en enkelt celletype, der dyrkes som et monolag på vævskulturplast (TCP); en todimensional (2D) stiv overflade langt mindre elastisk og porøs end de tredimensionale (3D) miljø celler udsættes for inden et væv eller organ. Dyremodeller har traditionelt været employed at bekræfte effekter fundet in vitro også oversætte til hele væv, og kan også anvendes som prækliniske platforme til at undersøge humane sygdomme. Men indbyrdes artsforskelle underminere denne afhængighed dyremodeller i vores forståelse af sygdom hos mennesker -. For eksempel er meget forståelse af lungesygdom astma baseret på en musemodel trods iboende forskelle mellem den menneskelige tilstand og denne model herunder få tegn på mastcelle infiltration af glatte muskler i luftvejene bundt, eller evnen til sygdomsudvikling spontan i dyret model 3,4. Der er også etiske overvejelser vedrørende brugen af dyremodeller, med "3R" standard "udskiftning, raffinement, og reduktion" i dyreforsøg bliver opmuntret i Storbritannien og andre lande.
Et attraktivt alternativ ville være sammenfatning af humant væv in vitro skabe strukturs til at undersøge den kooperative karakter mellem voksne humane celletyper i en enkelt enhed. Findes celler i 3D multi-cellulære strukturer i væv, hver især inden for et unikt mikro-miljø. Dyrkningen af celler på TCP kun tillader kulturen i cellemonolag, ude af stand til at replikere dette miljø, eller tilvejebringe evnen til multi-cellekultur. Biomaterialer avancement giver mulighed for at udvikle både naturlige og syntetiske 3D platforme for cellekultur. Decellulariseret ECM kan bruges til 3D cellekultur når recellularized med andre celletyper, herunder stamceller 1, men sådanne protokoller kan være komplekse og tidskrævende, med tilgængeligheden af væv begrænset og hovedsagelig af ikke-human oprindelse. Andre protokoller tillader større kontrol over de cellulære miljøer skabt såsom nanoimprinting, ECM deposition, celle ark teknologier eller elektrospinning. Elektrospinning skaber ikke-vævede 3D porøse måtter af fibre med diametre fra nanometer til mikrometer, replicating naturlige ECM dimensioner. Elektrospundne stilladser i stigende grad ansat som 3D-cell dyrkning platforme -. Manipulation af de elektrospinding parametre tillader indviklede kontrol over stillads egenskaber såsom porestørrelse, fiberdiameter, topografiske og justering og overfladekemi. Ændringer i sådanne parametre er blevet vist at direkte påvirke celleadhæsion og vækst, når cellerne blev dyrket i isolation.
Disse fordele er blevet udnyttet i den foreliggende undersøgelse at tillade dyrkning af flere celletyper som en enkelt 3D vævskonstruktion, ved hjælp af luftvejs bronchiole som model 3D vævsstruktur. Den bronchiole væg består af tre vigtigste regioner (Figur 1). Slimhinden er hvor luftvejs-epitelceller sidde ved luft-væske-grænsefladen (ALI), hvilket giver en væsentlig hindring for det ydre miljø. De bor på reticular basalmembranen (RBM), en tæt kompakt ECM består hovedsageligt af collagen IV, perlecans og lamininer. Sub-mucosale lag findes direkte under slimhinden, en mere porøse område bestående af flere celletyper, herunder fibroblaster, myofibroblaster og infiltrerende leukocytter under sygdomstilstande. Endelig glatte muskelceller bundter wrap omkring luftvejene i en spiralformet måde og består af flugtende plader af luftvejenes glatte muskulatur (ASM). Det er den glatte muskulatur relative kontraktile tilstand, der styrer luftvejs tone. Ansættelse af elektrospundne stilladser i det pulmonale system var indtil for nylig været begrænset til regenerative formål; med en elektrospundne tracheal udskiftning med succes transplanteret. Mens vellykket, sådanne behandlinger er begrænsede i antal, og er fokuseret på luftrøret grund af den relative simple karakter af vævets funktion. Begrænsede eksempler på luftvejs-modeller, der anvendes til in vitro diagnostik findes, og er hovedsagelig fokuseret på glatmuskelkontraktion målinger. Den ikke-toksiske og ikken-nedbrydelig polymer polyethylenterephthalat (PET) tidligere er elektrospindes, og blev anvendt i den foreliggende undersøgelse at sikre stilladser producerede kunne opbevares i lange perioder uden at forringe (tillade dem at blive brugt "off the shelf"), og også være egnede for stabil cellekultur over lange tidsrum. Tidligere undersøgelser fra vores gruppe har vist, at anvendelse af tre varianter af en basisk elektrospinning-protokollen, kan tre individuelle PET elektrospundne scaffolds fremstilles for at tilvejebringe optimale topografi til dyrkning luftvejs epithelial, fibroblast, og glatte muskelceller i isolation 21,22 og cokultur af luftvejs epiteliale og fibroblastceller 22. Fiberdiameter blev fundet at høj grad påvirke epithelial funktionalitet 22, og fiber alignment tillod frembringelsen af flugtende plader af glat muskulatur 21. Disse undersøgelser blev udført uafhængigt af hinanden under statiske forhold. I den foreliggende undersøgelse, disse Forskelnt stilladser, der indeholder fuldt differentierede voksne humane celler er blevet samdyrket i en uge på ALI i et kommercielt tilgængeligt bioreaktor som 3D-sektion af luftvejen væg, hvilket giver en fysiologisk relevant in vitro model for at undersøge luftvejs inter-cellulære responser. Mens denne protokol bruger luftvejene bronchiole som modelsystem, kunne det tilpasses som en platform for 3D cokultur af slimhinde enheder fra andre organer.
Evnen til at electrospin polymere fibre med strukturelle egenskaber sammenlignelige med naturlig ECM har ført til talrige naturlige eller syntetiske polymerer eller polymerblandinger bliver elektrospundet at genskabe disse miljøer,. Manipulation af procesparametre (herunder polymer valg, koncentration polymer, opløsningsmiddel, nålespidsen afstand og temperatur) kan alle indflydelse stillads egenskaber; men nogle parametre kan have større indflydelse på stillads egenskaber end andre 25,. Når modificering PET-fiber diameter, fandt vi de vigtigste parametre for at være koncentrationen af den anvendte polymer, den hastighed, ved hvilken polymeropløsningen var elektrospundet, og nålen diameter. Når elektrospinding aligned fibre de vigtigste parametre er samlingen anvendte metode (en roterende dorn), og den hastighed, hvormed dornen roterer. Ved at reducere dornen hastighed til 60 rpm, fandt vi tilfældigt afstemt stilladser produceret viste større stillads uniensstemmelse forhold til elektrospinding på en flad solfanger plade.
De karakteristiske træk ved decellulariseret luftveje væv blev analyseret for at give vejledning til de forskellige stillads topografier udviklet til kulturen i hver luftvejs celle-type. Elektrospundne nanofibre er en attraktiv stillads til at replikere membranstrukturer basement grund af det lille porestørrelse men høj samlet porøsitet, der giver mulighed for øget metabolit diffusion samtidig begrænse cellulær bevægelse. 9 Mens optimere elektrospinning parametre, blev en række PET koncentrationer og strømningshastigheder testet. De tyndeste fibre blev opnået ved anvendelse af en 6% vægt / volumen PET opløsning, der tidligere blev anvendt af andre grupper. Men høje niveauer af beading, og manglende ensartethed var konstant problemer. Indledende forsøg på at fjerne den beading inkluderet tilsætning af et kationisk overfladeaktivt middel, cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), til opløsningen for at nedsætte overfladespændingen og teste forskellige kilderaf PET. Tilsætningen af overfladeaktive reduceret mængden af beading, men ikke helt. Efter forsøger en række kommercielle kilder til PET-pellets blev fødevarekvalitet drikkeflaske anvendte PET, ved at skære op drikkeflasker og opløse disse i DCM: TFA solvent opløsning. Bruge dette som PET kilde resulterede i en stigning i fiber ensartethed og en reduktion i fiber beading. Ved at øge opløsningens koncentration smule til 8% vægt / volumen og reducere nålens diameter (18G til 23G) vi konsekvent fremstilles defekt frie nanofibre med en fiberdiameter på omkring 250 nm. Elektrospundne nanofiber stilladser kan være meget elektrostatisk ved afhentning fra dornen gør manuel håndtering af stilladser vanskelige. Dette blev forbedret ved lagring af stilladser i alufolie efter spinding og iblødsætning i 70% IMS før brug. Dette syntes at hjælpe sprede den resterende elektrostatiske ladning tilbage på stilladset fra elektrospinningsprocessen.
At give topographies svarer til de enkelte mikromiljøer støder de tre vigtigste luftveje celletyper inden luftvejene væg blev en basisk elektrospinning protokol indrettet til at frembringe tre unikke stillads til disse celletyper: ved elektrospinding en lav koncentration PET opløsningen langsomt, blev tilfældigt aligned nanofibre genereret, hvorpå epitelceller blev podet (efterligne RBM). Ved elektrospinding en højere koncentration PET opløsning ved en hurtigere hastighed, blev tilfældigt aligned mikrofibre genereret (fremstilling af et mere porøst stillads), ind i hvilken fibroblaster blev podet (efterligne sub-mucosale område umiddelbart under RBM). Ved elektrospinding en lav koncentration PET opløsningen på en høj hastighed roterende dorn afstemt nanofibre blev produceret, på hvilken glatte muskelceller orienteret i fiberretningen, producerer justeret ark af celler.
Øget fiberdiametre føre til øget porestørrelse, så større celle penetration ind stilladser og så hjælpe med at skabe en ægte 3D-miljø,. Microfiber stilladser blev anvendt til dyrkning af fibroblaster i undersøgelsen for at sikre, at cellerne boet på flere planer inden stilladset. Ved at øge PET koncentrationen til 30% vægt / volumen, blev PET fibre med en gennemsnitlig diameter på 2,5 um produceret. Fibre større diameter (≈ 4 um) blev fremstillet under anvendelse af en 35% vægt / volumen PET løsning, men stillads tykkelsesensartethed var tabt, og højere variabilitet mellem individuelle fibre var tydelig. Porer i microfiber stillads var over 7 gange større end dem, måles i nanofiber stilladser (10.45 pm vs 1,43 um), men stadig statisk podning af celler forudsat begrænset cellulær penetration. Dette blev forbedret ved dynamisk podning af celler under anvendelse af en orbital mixer, en fremgangsmåde vist at være effektiv tidligere.
Stærkt justeret nanofiber stilladser blev skabt ved elektrospinding en 10%vægt / volumen PET løsning på dornen roterer ved 2.000 rpm (≈ 440 m · min -1). PET-koncentrationen blev forøget fra 8% for at forhindre et uregelmæssigt bølge-lignende morfologi at fibre udstillet ved lavere koncentrationer. Trods stigningen i koncentrationen, tilpasse fibrene reduceret den gennemsnitlige fiber diameter (216 nm vs 255 nm, justeret vs tilfældig). Den høje hastighed af dornen trække fibrene ud, før de er tørret, er tilbøjelige til at forårsage denne virkning. Tilpasningen af fibrene påvirket tilpasningen af ASM celler, og har også andre fysiologiske virkninger på ASM celler, som er blevet karakteriseret andetsteds 21.
Den største begrænsning ved denne protokol er den manglende evne til at afbilde levende celler på / i strukturerne gør initial celle-vedhæftning eller differentiering over en længere tidsperiode umuligt at afgøre uden at ofre prøver. Det betyder mest optimering opstår efter kulturen periode dvs fixing prøver og derefter måle, om cellekultur lykkedes efter ikke under cellekultur. Observere en farveændring i stilladser inkuberet i alamarBlue (blå til pink) angiver celler er til stede og levedygtige, men er ikke ideel. Elektrospinding mere transparente polymerer, såsom gelatine kunne hjælpe med at visualisere celler på stilladser. Elektrospinningsprocessen af en nanofibrous stillads i vores model tillod replikationen af luftvejen ringmekanismer, ligeledes består af tætte nanofibre, hvor epitelcellerne bor. Det er tidligere blevet vist, at strukturelle celler ikke kan migrere gennem nanofiber stillads 22, selv immunceller er i stand til (data ikke vist). Mens fordelagtigt til dyrkning af bestemte celletyper på en 3D overflade (såsom epitel- og endotelceller), kan dette forebyggelse af strukturel cellemigration gennem nanofibre være skadeligt for dyrkning af andre celletyper. Så glat muskel er ikke i stand til at vandre gennem the aligned nanofiber stillads vi samlet tri-lags cokultur med den glatte muskulatur og fibroblast lag vender mod hinanden (i modsætning til den linie stillads adskiller de to celletyper). Mens dette gør det muligt for cellerne at være i tæt apposition, kan den aktuelle undersøgelse ikke konkludere, om den ene celletype (enten fibroblast eller glat muskulatur) vil overhale hele lag over et mere forlænget dyrkningsperiode. På trods af disse begrænsninger, har en levedygtig tri-lags model af luftvejene væg blevet udviklet, som et alternativ platform til at undersøge samspillet mellem disse mange celletyper. En lignende tri-lags undersøgelse er for nylig blevet offentliggjort, hvor fibroblaster blev indlejret i en cylindrisk collagen I Hydrogel med glat muskulatur podet på den ydre overflade og epitelceller i luminale overflade 17. Den mekaniske stabilitet af elektrospundne stilladser her udviklede ville tillade lignende rørformede konstruktioner, der skal dannes, og er stadig en aktuel reseaRCH sigte inden for vores gruppe. Mens undersøgelsen har fokuseret på luftvejene, flere organer i kroppen deler denne grundlæggende slimhinde strukturel enhed, og gennem modificering lejerne fremhævet i denne undersøgelse, kunne udvikles lignende platforme til væv, som indeholder en basalmembran enhed, herunder blodkar, blæren og hornhinden, hvor kollagen baserede multi-lag modeller er blevet anvendt.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |