Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
Der Bereich der regenerativen Medizin und des Tissue Engineering schnell voran, mit Durchbrüchen in der Luftröhre und Nierenregeneration zwei bemerkenswerten jüngsten Erfolge. Die im Tissue Engineering entwickelte Biomaterialien werden immer zugänglich, mit Möglichkeiten, solche Protokolle auf weniger spezialisierten Laboratorien zu übertragen. Ein Feld vorbereitet, um durch zunehmende Nutzung von Biomaterialien profitieren ist in-vitro-Diagnostik.
In-vitro-Studien sind eine wichtige Plattform, um intra-zelluläre Signalwege innerhalb der einzelnen Zelltypen zu untersuchen und dazu beigetragen haben, zu beschreiben Mechanismen, die zahlreiche Krankheiten Pathophysiologien. Diese Studien beruhen im allgemeinen auf einem einzigen Zelltyp ist als eine Monoschicht auf Gewebekultur-Plastik (TCP) kultiviert; eine zweidimensionale (2D) starre Oberfläche weit weniger elastisch und porös als die dreidimensionale (3D) Umgebung Zellen innerhalb eines Gewebes oder Organs ausgesetzt ist. Tiermodelle sind traditionell employed Effekte in vitro wurde auch festgestellt, um das gesamte Gewebe zu übersetzen zu bestätigen, und kann auch als vorklinischen Plattformen verwendet werden, um Krankheiten des Menschen untersucht werden. Jedoch Unterschiede zwischen den Arten zu untergraben dieses Vertrauen in Tiermodellen in unserem Verständnis der menschlichen Krankheiten -. So wird beispielsweise viel Verständnis für die Lungenerkrankung Asthma bei trotz inhärenten Unterschiede zwischen der menschlichen Existenz und das Modell einschließlich wenig Hinweise auf Mastzellinfiltration der glatten Atemwegsmuskulatur bundle, oder die Fähigkeit zur spontanen Entwicklung der Krankheit im Tier einem Mausmodell basiert modellieren 3,4. Es gibt auch ethische Überlegungen in Bezug auf die Verwendung von Tiermodellen, mit der "3R" Standard "Ersetzung, Verfeinerung und Reduzierung" in Tierversuchen, die in Großbritannien und anderen Ländern gefördert.
Eine attraktive Alternative wäre die Reprise von menschlichem Gewebe in vitro schaffen Strukturs, um den kooperativen Charakter zwischen erwachsenen Menschen Zelltypen in einem einzigen Gerät zu untersuchen. Zellen existieren in 3D mehrzelligen Strukturen im Gewebe, jeweils in einem einzigartigen Mikroumgebung. Das Kultivieren von Zellen auf TCP erlaubt nur die Kultur von Zell-Monoschichten, nicht auf dieses Umfeld zu replizieren, oder bieten die Fähigkeit zur Mehrzellenkultur. Biomaterials Weiterentwicklung bietet die Möglichkeit, sowohl natürliche als auch synthetische 3D-Plattformen für die Zellkultur zu entwickeln. Dezellularisierte ECM kann für 3D-Zellkultur verwendet werden, wenn sie mit anderen Zelltypen einschließlich Stammzellen 1 rezellularisiertes jedoch solchen Protokollen kann komplex und zeitaufwendig sein kann, mit der Verfügbarkeit von Gewebe begrenzt ist und im Wesentlichen aus nicht-menschlichen Ursprungs. Andere Protokolle ermöglichen eine bessere Kontrolle über die zellulären Umgebungen erstellt, wie Nanoimprint, ECM Abscheidung Zellschicht Technologien oder Elektrospinnen. Elektrospinnen erzeugt Vlies 3D poröse Matten aus Fasern mit Durchmessern von Nanometern bis Mikrometern, replicating natürlichen ECM Dimensionen. Elektro Gerüste werden zunehmend als 3D-Zellkultur-Plattformen verwendet -. Manipulation der Elektrospinnen Parameter ermöglicht komplizierte Kontrolle über Gerüst Eigenschaften wie Porengröße, Faserdurchmesser, Topographie und Ausrichtung und Oberflächenchemie. Änderungen solcher Parameter sind gezeigt worden, um unmittelbar auf die Zelladhäsion und Wachstum, wenn die Zellen isoliert, kultiviert.
Diese Vorteile wurden in der vorliegenden Studie ausgenutzt, um die Kultivierung von mehreren Zelltypen als einzelne 3D-Gewebekonstrukt zu ermöglichen, mit dem Atemweg bronchiole als Modell 3D-Gewebestruktur. Die bronchiole Wand besteht aus drei Hauptbereichen (Abbildung 1). Die Schleimhaut ist, wo Atemwegsepithelzellen sitzen an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) und bietet eine wichtige Barriere gegen die äußere Umgebung. Sie befinden sich auf dem retikulären Basalmembran (RBM), ein dicht kompakte ECM hauptsächlich aus collag umfassteen IV, perlecans und Laminine. Die submuköse Schicht direkt unterhalb der Schleimhaut, einer porösen Bereich von mehreren Zelltypen, einschließlich Fibroblasten, Myofibroblasten und infiltrierenden Leukozyten unter Krankheitsbedingungen umfasst gefunden. Schließlich glatte Muskelbündel umschlingen den Luftweg in einer spiralförmigen Art und Weise, und werden von ausgerichteten Folien aus glatten Atemwegsmuskulatur (ASM) besteht. Es ist relativ Kontraktionszustand der glatten Muskulatur der Atemwege, die Klangregler. Der Einsatz von elektro Gerüste im Lungensystem hatte bis vor kurzem auf regenerative Zwecke beschränkt worden; mit einem elektroLuftRöhrenErsatz erfolgreich transplantiert. Obwohl erfolgreich, sind solche Behandlungen in begrenzter Zahl und werden von der Trachea infolge der relativen einfachen Natur der Funktion des Gewebes konzentriert. Begrenzte Beispiele von Atemwegs Modelle für die in vitro Diagnostik verwendet existieren, und in erster Linie auf Kontraktion der glatten Muskulatur Messungen konzentriert. Die nicht-toxisch und nichtn-abbaubares Polymer Polyethylenterephthalat (PET) wurde zuvor elektrogesponnen wurde, und wurde in der vorliegenden Studie auf Gerüsten hergestellt könnte für längere Zeit gelagert werden ohne Beeinträchtigung zu gewährleisten beschäftigt (so dass sie "von der Stange" verwendet werden), aber auch geeignet sein für stabile Zellkultur über einen längeren Zeitraum. Frühere Studien von unserer Gruppe haben gezeigt, daß die Verwendung von drei Variationen einer Basiselectro Protokoll können drei einzelne PET elektroGerüsten hergestellt werden, um eine optimale Topographien für die Kultivierung Atemwegsepithelzellen, Fibroblasten und glatten Muskelzellen in Isolation 21,22 und der Co-Kultur von Atemwegs bereitzustellen epitheliale und Fibroblasten-Zellen 22. Faserdurchmesser wurde festgestellt, epithelialen Funktionalität 22 großen Einfluss, und Faserausrichtung erlaubt die Erzeugung von ausgerichteten Blätter der glatten Muskulatur 21. Diese Studien wurden unabhängig voneinander unter statischen Bedingungen durchgeführt. In der vorliegenden Studie werden diese different Gerüste ausdifferenzierten erwachsenen menschlichen Zellen enthalten, wurden für eine Woche bei ALI in einem handelsüblichen Bioreaktor als 3D-Abschnitt der Atemwegswand kokultiviert worden, die eine physiologisch in vitro-Modell relevant Atemwegsinterzelluläre Reaktionen zu untersuchen. Während dieses Protokolls wird mit dem Atemweg bronchiole als Modellsystem, als Plattform für die 3D-Kokultur Schleimhaut Einheiten anderer Organe angepasst werden könnten.
Die Fähigkeit, Polymerfasern mit strukturellen Eigenschaften vergleichbar mit natürlichem ECM elektrospinnen hat zu zahlreichen natürlichen oder synthetischen Polymeren oder Polymermischungen als elektro diese Umgebungen neu geführt. Manipulation der Prozessparameter (einschließlich Polymer Wahl, Polymerkonzentration, Lösungsmittel, Nadelspitze Entfernung und Temperatur) können alle Einfluss Gerüst Eigenschaften; aber einige Parameter haben größeren Einfluss auf Gerüst Eigenschaften als andere 25,. Beim Ändern PET Faserdurchmesser, fanden wir die Schlüsselparameter, um die Konzentration des Polymers verwendet wird, die Rate, mit der die Polymerlösung war elektro und Durchmesser der Nadel ist. Beim Elektrospinnen ausgerichteten Fasern die wichtigsten Parameter sind die (a rotierenden Dorn) Sammlungsverfahren, und die Geschwindigkeit, mit der sich der Dorn dreht. Durch die Verringerung der Dorngeschwindigkeit auf 60 Umdrehungen pro Minute, fanden wir, die nach dem Zufallsprinzip ausgerichtet Gerüste hergestellt zeigte eine größere Gerüst uniKonformität gegenüber Elektrospinnen auf einer flachen Kollektorplatte.
Die Merkmale des dezellularisierten Atemwegsgewebe wurden analysiert, um Führung für die verschiedenen Gerüst Topographien für die Kultur von jedem Luftweg Zelltyp entwickelt werden. Elektrogesponnenen Nanofasern sind ein attraktiver Gerüst Basalmembran Strukturen aufgrund der geringen Porengröße aber insgesamt hohe Porosität, die für eine erhöhte Stoffwechsel Diffusion, während die Beschränkung zelluläre Bewegung ermöglicht replizieren. 9 Während der Optimierung der Elektrospinnparameter, wurden eine Reihe von PET-Konzentrationen und Flussraten getestet. Die dünnsten Fasern wurden mit einem 6% Gewicht / Volumen PET-Lösung, die zuvor von anderen Gruppen verwendet werden, erreicht. Jedoch ein hohes Maß an Perlen, und ein Mangel an Einheitlichkeit waren ständig Probleme. Anfängliche Versuche, um das Bördeln entfernen enthalten Zugabe eines kationischen Tensids, Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), zu der Lösung, um die Oberflächenspannung zu senken, und das Testen verschiedener Quellenvon PET. Die Zugabe von Tensid reduziert die Menge der Perlen, aber nicht vollständig. Nach dem Versuch, eine Reihe von kommerziellen Quellen von PET-Granulat, Trinken Lebensmittelqualität Flasche PET verwendet wurde, durch Zerschneiden Getränkeflaschen und Auflösen dieser in der DCM: TFA Lösungsmittel-Lösung. Mit diesem als die PET Quelle führte zu einer Erhöhung der Fasergleichmäßigkeit und eine Verringerung der Faser Bördeln. Durch Erhöhung der Lösungskonzentration leicht auf 8% G / V und die Verringerung der Nadeldurchmesser (18G bis 23G) wir konsequent defektfreie Nanofasern mit einem Faserdurchmesser von etwa 250 nm hergestellt. Elektrogesponnenen Nanofasergerüste können stark elektro bei der Abholung vom Dorn macht manuelle Handhabung der Gerüste schwierig sein. Dies wurde durch die Speicherung der Gerüste in Aluminiumfolie nach dem Spinnen und Einweichen in 70% IMS vor der Anwendung verbessert. Dies schien zu helfen, leiten die elektrostatische Aufladung Rest links auf dem Gerüst aus der Elektrospinnverfahren.
Nach oben stellenographien ähnlich wie die einzelnen Mikroumgebungen von den drei wichtigsten Atemwegszelltypen innerhalb der Atemwege Wand gestoßen, eine grundlegende Elektro Protokoll wurde angepasst, um drei einzigartige Gerüste für diesen Zelltypen herzustellen: durch Elektrospinnen einer niedrigen Konzentration PET Lösung langsam, wurden zufällig ausgerichteten Nanofasern erzeugt wird, , auf die Epithelzellen wurden ausgesät (imitiert die RBM). Durch Elektrospinnen einer höheren Konzentration PET-Lösung bei einer schnelleren Rate, wurden zufällig ausgerichteten Mikrofasern erzeugt (Herstellung eines poröser Scaffold), de welche Fibroblasten ausgesät (Nachahmung der submukösen Bereich unmittelbar unterhalb der RBM). Durch Elektrospinnen einer niedrigen Konzentration PET Lösung auf eine mit hoher Geschwindigkeit drehenden Dorn ausgerichteten Nanofasern wurden hergestellt, auf die glatten Muskelzellen in der Faserrichtung orientiert, wodurch ausgerichteten Blätter von Zellen.
Erhöhte Faserdurchmesser führen zu einer erhöhten Porengröße, so dass größere Zell penetration in Gerüsten und so zur Schaffung eines echten 3D-Umgebung,. Mikrofaser Gerüste wurden für die Kultivierung von Fibroblasten in der Studie verwendet, um sicherzustellen, dass die Zellen residiert auf mehreren Ebenen innerhalb des Gerüsts. Durch Erhöhung der PET Konzentration von 30% Gewicht / Volumen, wurden PET-Fasern mit einem mittleren Durchmesser von 2,5 um hergestellt. Größeren Durchmesser Fasern (≈ 4 um) wurden unter Verwendung einer 35% wt / vol PET-Lösung hergestellt, jedoch Gleichförmigkeit Gerüstdicke war verloren und höhere Variabilität zwischen einzelnen Fasern war offensichtlich. Poren in der Mikrofaser Gerüst waren mehr als 7-mal größer als die in den Nanofasergerüste gemessen (10,45 & mgr; m vs 1,43 & mgr; m), aber immer noch statische Aussaat von Zellen bereitgestellt begrenzten zellulären Penetration. Dies wurde durch dynamisches Aussäen der Zellen unter Verwendung eines Orbitalmischers, gezeigt, dass sie eine zuvor wirksame Methode verbessert.
Stark ausgerichtete Nanofasergerüste wurden durch Elektrospinnen einer 10% erstelltbei 2000 Upm Gewicht / Volumen PET-Lösung auf den Dorn dreh (≈ 440 m · min -1). Die PET-Konzentration von 8% erhöht werden, um ein unregelmäßiges wellenförmige Morphologie, die Fasern bei niedrigeren Konzentrationen zeigten verhindern. Trotz der Zunahme der Konzentration, die Ausrichtung der Fasern reduziert die durchschnittlichen Faserdurchmesser (216 nm gegen 255 nm, gegen zufällige ausgerichtet). Die hohe Geschwindigkeit des Dorns Ziehen der Fasern, bevor sie getrocknet wurden, dürfte diese Wirkung hervorrufen. Die Ausrichtung der Fasern beeinflusst die Ausrichtung des ASM-Zellen und auch andere physiologische Wirkungen auf die ASM-Zellen, die bereits an anderer Stelle 21 gekennzeichnet sind.
Die Haupteinschränkung dieses Protokolls ist die Unfähigkeit, Bild lebenden Zellen auf / in den Gerüsten Treffen Sie zunächst die zell Befestigung oder Differenzierung über einen längeren Zeitraum nicht möglich, ohne Proben zu bestimmen. Das bedeutet, die meisten Optimierung nach der Kulturperiode auftritt, dh fixing Proben und dann die Messung, ob der Zellkultur wurde erfolgreich nach der nicht während der Zellkultur. Beobachten einer Farbänderung in Gerüste in alamarBlue inkubiert (blau zu rosa) zeigt Zellen vorhanden und lebensfähig sind, ist aber nicht ideal. Elektrospinnen transparenter Polymere wie Gelatine konnten bei der Visualisierung Zellen auf den Gerüsten zu unterstützen. Das Elektrospinnen einer Nanofasergerüst innerhalb unseres Modells erlaubt die Replikation des Atemwegs RBM, ähnlich dichten Nanofasern auf der die Epithelzellen wohnen zusammen. Es wurde zuvor gezeigt, dass Strukturzellen nicht durch die Nanofasergerüst 22 wandern, obwohl Immunzellen in der Lage sind (Daten nicht gezeigt). Während für die Kultivierung von spezifischen Zelltypen auf einer 3D-Oberfläche vorteilhaft (wie epitheliale und endotheliale Zellen), kann diese Prävention struktureller Zellmigration durch die Nanofasern nachteilig für die Kultivierung von anderen Zelltypen sein. Wie der glatten Muskulatur kann nicht durch Th migrierene ausgerichtet Nanofasergerüst montiert wir die dreischichtige Co-Kultur mit der glatten Muskelzellen und Fibroblasten-Schichten einander gegenüber (an der ausgerichteten Gerüst zwischen den beiden Zelltypen gegenüber). Während dies ermöglicht es den Zellen, die in enger Apposition ist, kann die vorliegende Studie nicht feststellen, ob ein Zelltyp (entweder die Fibroblasten oder glatten Muskelzellen) würde die gesamte Schicht über eine längere Kulturzeit zu überholen. Trotz dieser Einschränkungen ist eine lebensfähige Dreischichtmodell der Atemwegswand entwickelt, das eine alternative Plattform, um die Wechselwirkungen zwischen diesen multiplen Zelltypen zu untersuchen. Eine ähnliche dreischichtigen Studie wurde kürzlich veröffentlicht, wo Fibroblasten wurden in einem zylindrischen Kollagen I Hydrogels mit glatten Muskelzellen auf der äußeren Oberfläche und Epithelzellen innerhalb der luminalen Oberfläche 17 ausgesät eingebettet. Die mechanische Stabilität der elektroGerüste hier entwickelten wäre ähnlich Rohr ermöglichen Konstrukte gebildet werden soll, und bleibt ein Strom research Ziel innerhalb unserer Gruppe. Während die Studie über die Atemwege, verschiedene Organe im Körper teilen diese Grund Schleimhaut-Struktureinheit und durch Veränderung der Mieter konzentriert in dieser Studie hervorgehoben, könnten ähnliche Plattformen für Gewebe, das eine Basalmembran Einheit, die Blutgefäße, die Blase und entwickelt werden Die Hornhaut, wobei auf Kollagenbasis mehrschichtigen Modellen verwendet worden.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |