Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
Il campo della medicina rigenerativa e dell'ingegneria tissutale sta avanzando rapidamente, con innovazioni nella tracheale e rene rigenerazione due successi recenti di rilievo. I biomateriali sviluppati in ingegneria dei tessuti sono sempre più accessibili, con la possibilità di trasferire tali protocolli per laboratori meno specializzate. Un campo innescato beneficiare attraverso crescente utilizzo di biomateriali è la diagnosi in vitro.
Studi in vitro sono una piattaforma importante per indagare vie di segnalazione intra-cellulari all'interno singoli tipi di cellule, e hanno contribuito a delineare meccanismi alla base numerosi pathophysiologies malattia. Questi studi in genere si basano su un singolo tipo cellulare in coltura come un monostrato su coltura tissutale di plastica (TCP); un (2D) superficie rigida bidimensionale molto meno elastica e porosa rispetto ai tridimensionali cellule (3D) di ambiente sono esposti a meno di un tessuto o organo. I modelli animali sono stati tradizionalmente employed confermare effetti riscontrati in vitro anche tradurre al tessuto intero, e può anche essere utilizzato come piattaforme pre-clinici per investigare malattie umane. Tuttavia, le differenze tra le specie minano questo affidamento su modelli animali nella nostra comprensione delle malattie umane -. Ad esempio, molta comprensione dell'asma malattia polmonare si basa su un modello di topo nonostante le differenze intrinseche tra la condizione umana e questo modello compreso poche prove di infiltrazione mastociti delle vie aeree fascio muscolare liscia, o la capacità di sviluppo della malattia spontanea all'interno dell'animale modellare 3,4. Ci sono anche considerazioni etiche riguardanti l'uso di modelli animali, con lo standard "3R" di "sostituzione, affinamento e riduzione" in sperimentazione animale essere incoraggiati nel Regno Unito e in altri paesi.
Una valida alternativa potrebbe essere la ricapitolazione di tessuti umani nella struttura creazione vitros per indagare la natura cooperativa tra i tipi di cellule umane adulte in una singola unità. Esistono Cells in strutture pluricellulari 3D all'interno del tessuto, ciascuno all'interno di un micro-ambiente unico. La coltura di cellule su TCP consente solo la cultura di monostrati cellulari, in grado di replicare questo ambiente, o fornire la capacità per la cultura multi-cellule. Biomateriali avanzamento offre l'opportunità di sviluppare entrambe le piattaforme naturali e sintetici 3D per coltura cellulare. ECM decellularized può essere utilizzato per la coltura cellulare 3D quando recellularized con altri tipi di cellule, comprese le cellule staminali 1, tuttavia tali protocolli possono essere complessa e richiede tempo, con la disponibilità limitata di tessuto e in gran parte di origine non umana. Altri protocolli consentono un maggiore controllo sulle ambienti cellulari creati come nanoimprinting, ECM deposizione, tecnologie foglio cellulare o electrospinning. Electrospinning crea tappeti non tessuto 3D porosi di fibre con diametri da nanometro a micrometri, replicating dimensioni ECM naturali. Ponteggi elettrofilate sono sempre più utilizzati come piattaforme di coltura cellulare 3D -. La manipolazione dei parametri elettrofilatura permette il controllo intricato su caratteristiche patibolo come dimensione dei pori, diametro delle fibre, la topografia e l'allineamento, e la chimica di superficie. Alterazioni di tali parametri hanno dimostrato di influenzare direttamente adesione e crescita cellulare, quando le cellule sono state coltivate in isolamento.
Questi vantaggi sono state sfruttate nel presente studio per permettere la coltura di tipi di cellule come un unico costrutto tessuto 3D, utilizzando bronchiolo vie aeree come struttura tissutale modello 3D. La parete bronchiole consiste di tre regioni principali (Figura 1). La mucosa è dove le cellule epiteliali delle vie aeree siedono all'interfaccia aria-liquido (ALI), fornendo una barriera importante per l'ambiente esterno. Essi risiedono sulla membrana reticolare seminterrato (RBM), un ECM strettamente compatto composto principalmente di collagen IV, perlecans e laminine. Lo strato sub-mucosa è situato direttamente al di sotto della mucosa, una regione più porosa costituita da più tipi di cellule inclusi i fibroblasti, miofibroblasti e leucociti infiltranti in condizioni di malattia. Infine fasci muscolari lisce avvolgono le vie aeree in modo elicoidale e sono composti da fogli allineate di muscolatura liscia bronchiale (ASM). E 'stato contrattile relativo liscio del muscolo che controlla il tono delle vie aeree. L'impiego di ponteggi elettrofilate all'interno del sistema polmonare era fino a poco stato limitato a scopi rigenerativi; con un ricambio tracheale elettrofilate essere trapiantato con successo. Mentre il successo, tali trattamenti sono limitate in numero, e si concentrano sulla trachea a causa della semplice natura relativa della funzione del tessuto. Esistono esempi limitato di modelli vie aeree utilizzate per la diagnostica in vitro, e si concentrano principalmente su misure contrazione della muscolatura liscia,. Il non-tossico e nonn-degradabili polietilene polimero tereftalato (PET) è stata precedentemente elettrofilate, ed è stato impiegato in questo studio per garantire scaffold prodotti possono essere conservati per lunghi periodi senza degradare (permettendo loro di essere utilizzati "off the shelf"), e anche essere adatto per colture cellulari stabili per periodi di tempo prolungati. Studi precedenti del nostro gruppo hanno dimostrato che l'impiego di tre varianti di un protocollo di base elettrospinning, tre singoli ponteggi elettrofilate PET possono essere prodotti per fornire topografie ottimali per la coltura epiteliale delle vie aeree, fibroblasti e cellule muscolari lisce in isolamento 21,22 e il coculture di vie respiratorie cellule epiteliali e fibroblasti 22. Diametro Fiber è stato trovato per influenzare notevolmente la funzionalità epiteliale 22, e l'allineamento fibra ha permesso la generazione di fogli allineate di muscolatura liscia 21. Questi studi sono stati effettuati indipendentemente l'uno dall'altro, in condizioni statiche. Nel presente studio, questi differeponteggi nt, contenenti cellule umane completamente differenziate adulti sono stati messi in coltura per una settimana al ALI in un bioreattore disponibile in commercio come sezione 3D della parete bronchiale, fornendo un fisiologicamente rilevanti modello in vitro per indagare vie aeree risposte intercellulari. Mentre questo protocollo utilizza bronchiolo vie aeree come sistema modello, potrebbe essere adattato come una piattaforma per la coculture 3D di unità mucose da altri organi.
La capacità di electrospin fibre polimeriche con proprietà strutturali paragonabili a ECM naturale è portato a numerosi polimeri naturali o sintetici, o miscugli di polimeri essendo elettrofilate ricreare questi ambienti,. La manipolazione dei parametri di processo (tra cui la scelta del polimero, concentrazione del polimero, solventi, la distanza punta dell'ago e temperatura) tutti possiamo caratteristiche influenza impalcature; tuttavia alcuni parametri possono avere un impatto maggiore sulle proprietà impalcatura di altri 25,. Quando si modifica diametro della fibra PET, abbiamo trovato i parametri chiave per la concentrazione del polimero utilizzato, la velocità alla quale la soluzione polimerica era elettrofilate, e il diametro dell'ago. Quando electrospinning fibre allineate i parametri chiave sono il metodo di raccolta utilizzato (un mandrino rotante), e la velocità con cui ruota il mandrino. Attraverso la riduzione della velocità del mandrino a 60 giri al minuto, abbiamo trovato le impalcature allineate casualmente prodotte hanno mostrato maggiore uni ponteggioformità rispetto ad electrospinning su un piatto collettore piano.
Le caratteristiche dei tessuti delle vie aeree decellularized sono stati analizzati a fornire indicazioni per le varie topografie scaffold sviluppati per la cultura di ogni vie aeree tipo cellulare. Nanofibre elettrofilate sono un'impalcatura attraente per replicare strutture membrana basale a causa della piccola dimensione dei pori ma elevata porosità complessiva che permette di aumentare la diffusione metabolita pur limitando il movimento cellulare. 9 ottimizzando i parametri electrospinning, un intervallo di concentrazioni PET e portate sono stati testati. Le fibre più sottili sono stati ottenuti usando una soluzione peso / volume PET 6%, utilizzato in precedenza da altri gruppi. Tuttavia, gli alti livelli di bordatura, e una mancanza di uniformità erano problemi costanti. I primi tentativi per rimuovere la bordatura inclusa l'aggiunta di un tensioattivo cationico, cetiltrimetilammonio bromuro (CTAB), alla soluzione di abbassare la tensione superficiale, e testando varie fontidi PET. L'aggiunta del tensioattivo ridotto la quantità di bordatura, ma non completamente. Dopo aver provato un certo numero di fonti commerciali di pellet di PET, bevanda commestibile bottiglia in PET è stato utilizzato, tagliando bottiglie per bevande e sciogliere questi nella DCM: solvente TFA. Usando questo come sorgente PET ha comportato un aumento in fibra uniformità e una riduzione in fibra bordare. Aumentando la concentrazione della soluzione leggermente a 8% in peso / vol e riducendo il diametro dell'ago (18G a 23G) abbiamo costantemente prodotto nanofibre difetto liberi con un diametro di fibra di circa 250 nm. Ponteggi nanofibre elettrofilate possono essere altamente elettrostatiche al momento del ritiro dal mandrino facendo movimentazione manuale degli scaffold difficili. Questa è stata migliorata memorizzando i ponteggi in un foglio di alluminio dopo la filatura e immersi nel 70% IMS prima dell'uso. Questo sembrava contribuire a dissipare la carica elettrostatica residua sul patibolo dal processo electrospinning.
Per fornire topographies simile ai singoli microambienti incontrate dalle tre principali tipi di cellule delle vie aeree all'interno della parete delle vie aeree, un protocollo di base elettrospinning è stato adattato per la produzione di tre ponteggi unici per questi tipi di cellule: da elettrospinning una soluzione bassa concentrazione PET lentamente, sono stati generati nanofibre allineate in modo casuale, su cui le cellule epiteliali sono state seminate (mimando l'RBM). Con electrospinning una soluzione PET concentrazione superiore ad una velocità maggiore, sono stati generati microfibre allineate casualmente (producendo un'impalcatura più poroso), de cui fibroblasti sono stati seminati (mimando l'area sub-mucosa immediatamente sotto la RBM). Con electrospinning una soluzione a bassa concentrazione PET su una elevata velocità mandrino allineato nanofibre rotante sono stati prodotti, su cui le cellule muscolari lisce orientate nella direzione delle fibre, producendo fogli di cellule allineate.
Diametri delle fibre ad incrementare il vantaggio di una maggiore dimensione dei pori, permettendo una maggiore penetratio cellularen in impalcature e così contribuire a creare un vero ambiente 3D,. Ponteggi microfibra sono stati impiegati per la coltura di fibroblasti in studio per garantire che le cellule risiedevano su più piani all'interno del ponteggio. Aumentando la concentrazione di PET al 30% peso / volume, sono state prodotte fibre di PET con un diametro medio di 2,5 micron. Fibre di diametro maggiore (≈ 4 micron) sono stati prodotti utilizzando una soluzione di PET peso / volume del 35%, ma uniformità di spessore patibolo è stato perso, e una maggiore variabilità tra le singole fibre era evidente. I pori della patibolo microfibra sono stati oltre 7 volte superiore rispetto a quelli misurati in scaffold nanofibre (10,45 micron vs 1.43 micron, rispettivamente), ma semina ancora statica delle cellule forniti penetrazione cellulare limitato. Questa è stata migliorata mediante inseminazione dinamicamente le cellule utilizzando un miscelatore orbitale, un metodo dimostrato di essere efficace in precedenza.
Impalcature nanofibre altamente allineati sono stati creati da elettrospinning 10%wt / vol soluzione PET sul mandrino rotante a 2.000 giri (≈ 440 m · min -1). La concentrazione di PET è stato aumentato da 8% per evitare una morfologia ondulata irregolare che fibre esposte a concentrazioni inferiori. Nonostante l'aumento della concentrazione, allineando le fibre ridotto il diametro medio delle fibre (216 nm contro 255 nm, allineato rispetto casuale). L'alta velocità del mandrino disegnare le fibre fuori prima che abbiano secca è probabile che a causare questo effetto. L'allineamento delle fibre influenzato l'allineamento delle cellule ASM, e ha anche altri effetti fisiologici sulle cellule ASM che sono stati caratterizzati altrove 21.
Il principale limite di questo protocollo è l'incapacità di cellule vive di immagine sulla / nella scaffold rendendo cella attaccamento o differenziazione iniziale per un periodo di tempo prolungato impossibile determinare senza sacrificare campioni. Questo significa che la maggior parte di ottimizzazione si verifica dopo il periodo di coltura, cioè fissareing campioni e poi misurare se la coltura cellulare ha avuto successo dopo non durante coltura cellulare. Osservando un cambiamento di colore di ponteggi incubate a alamarBlue (blu al rosa) indica le cellule sono presenti e vitali, ma non è l'ideale. Elettrofilatura polimeri più trasparenti come la gelatina potrebbero aiutare a visualizzare le cellule sulle impalcature. La electrospinning di un ponteggio nanofibrous nel nostro modello ha permesso la replicazione del RBM vie aeree, analogamente composto da nanofibre densi in cui le cellule epiteliali risiedono. È stato precedentemente dimostrato che le cellule strutturali non possono migrare attraverso il nanofibre ponteggio 22, anche se le cellule immunitarie sono in grado di (dati non mostrati). Pur vantaggiosa per coltura di specifici tipi di cellule su una superficie 3D (quali cellule epiteliali ed endoteliali), tale prevenzione della migrazione cellulare strutturale attraverso nanofibre possono essere dannosi per la coltura di altri tipi di cellule. Come muscolatura liscia è in grado di migrare attraverso the allineato nanofibre impalcatura abbiamo assemblato la co-coltura tri-strato con il muscolo liscio e strati di fibroblasti di fronte all'altro (opposizione al patibolo allineati che separa i due tipi di cellule). Mentre questo permette alle cellule di essere in stretta apposizione, questo studio non può concludere se un tipo cellulare (sia fibroblasto o muscolo liscio) avrebbe superato tutto lo strato per un periodo più prolungato coltura. Nonostante queste limitazioni, un modello tri-strato praticabile della parete bronchiale è stato sviluppato che fornisce una piattaforma alternativa per indagare le interazioni tra questi diversi tipi di cellule. Uno studio simile tri-strato è stato recentemente pubblicato in cui fibroblasti sono stati incorporati entro un collagene cilindrica I idrogel con muscolatura liscia seminati sulla superficie esterna e le cellule epiteliali all'interno della superficie luminale 17. La stabilità meccanica degli scaffold elettrofilate sviluppati qui permetterebbe tubolare simile costruisce a formarsi, e rimane un resea correnterch scopo all'interno del nostro gruppo. Mentre lo studio è concentrata sulla vie aeree, diversi organi all'interno del corpo condividono questa unità strutturale mucosa base, e attraverso la modifica inquilini evidenziato in questo studio, piattaforme simili potrebbero essere sviluppati per tessuti contenenti un'unità membrana basale compreso vasi sanguigni, la vescica e la cornea, in cui sono stati impiegati modelli basati multistrato collagene.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |