Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.
Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created.
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.
O campo da medicina regenerativa e engenharia de tecidos está avançando rapidamente, com avanços na traquéia e nos rins regeneração duas conquistas recentes notáveis. Os biomateriais desenvolvidos na engenharia de tecidos estão se tornando mais acessíveis, com oportunidades para transferir tais protocolos para laboratórios menos especializados. Um campo preparado para se beneficiar através do aumento da utilização de biomateriais está em diagnóstico in vitro.
Os estudos in vitro são uma importante plataforma para investigar vias de sinalização intra-celulares dentro de tipos de células individuais, e ajudaram a delinear mecanismos subjacentes inúmeras pathophysiologies doença. Estes estudos geralmente dependem de um único tipo de célula a ser cultivada como uma monocamada em plástico de cultura de tecido (TCP); um bidimensional (2D) superfície rígida muito menos elástico e poroso do que as células de ambiente (3D) tridimensional são expostos a dentro de um tecido ou órgão. Os modelos animais têm sido tradicionalmente employed para confirmar os efeitos encontrados in vitro também se traduzem em todo o tecido, e também pode ser utilizado como plataformas pré-clínicos para investigar doenças humanas. No entanto, as diferenças entre espécies minar esta confiança em modelos animais em nossa compreensão da doença humana -. Por exemplo, muita compreensão da asma doença pulmonar é baseado em um modelo de rato, apesar das diferenças inerentes entre a condição humana e este modelo, incluindo pouca evidência de infiltração de mastócitos do feixe de músculo liso das vias aéreas, ou a capacidade de desenvolvimento da doença espontânea dentro do animal modelar 3,4. Há também considerações éticas relacionadas com a utilização de modelos animais, com o "3Rs" padrão de "substituição, aperfeiçoamento e redução" na experimentação animal que está sendo incentivada no Reino Unido e em outros países.
Uma alternativa atraente seria a recapitulação de tecido humano na estrutura criando vitros para investigar a natureza cooperativa entre os tipos de células de seres humanos adultos, em uma única unidade. As células existem em estruturas multicelulares 3D dentro de tecido, cada um dentro de um micro-ambiente único. A cultura de células em TCP só permite a cultura de monocamadas de células, incapazes de se replicar este ambiente, ou fornecer a capacidade para a cultura multi-celular. Biomateriais avanço proporciona a oportunidade de desenvolver ambas as plataformas 3D naturais e sintéticos para cultura de células. Descelularizado ECM pode ser utilizado para cultura de células 3D quando repovoados com outros tipos de células, incluindo células-tronco 1, no entanto, tais protocolos pode ser complexo e demorado, com a disponibilidade de tecido e limitada em grande parte de origem não-humana. Outros protocolos permitem maior controle sobre os ambientes celulares criadas como nanoimpressão, a deposição de ECM, tecnologias de camada de células, ou electrospinning. Electrospinning cria esteiras porosas 3D não-tecidos de fibras com diâmetros que variam de nanômetros para micrômetro, replicating dimensões ECM naturais. Andaimes electrospun são cada vez mais utilizados como plataformas de cultura de células em 3D -. Manipulação dos parâmetros Electrospinning permite o controle intrincado sobre características de andaime, tais como o tamanho dos poros, diâmetro da fibra, topografia e alinhamento, e química de superfície. As alterações de tais parâmetros foram mostrados para afectar directamente a adesão celular e o crescimento, quando as células foram cultivadas isoladamente.
Estas vantagens têm sido explorado no presente estudo para permitir que a cultura de vários tipos de células como uma única construção de tecido 3D, utilizando o bronquíolo das vias aéreas como uma estrutura de tecido modelo 3D. A parede bronquíolo consiste em três regiões principais (Figura 1). A mucosa é em que as células epiteliais das vias respiratórias sentar-se na interface ar-líquido (ALI), proporcionando uma barreira importante para o meio ambiente externo. Eles residem na membrana reticular basal (RBM), a ECM firmemente compacta composta principalmente de collagen IV, perlecans e lamininas. A camada de sub-mucosa encontra-se imediatamente abaixo da mucosa, uma região mais porosa composta por vários tipos de células incluindo fibroblastos, miofibroblastos e leucócitos de infiltração sob condições de doença. Finalmente feixes de músculo liso das vias aéreas a envolver em torno de uma forma helicoidal, e são constituídas por folhas alinhadas de músculo liso das vias aéreas (ASM). É parente estado contrátil do músculo liso do que controla o tônus das vias respiratórias. O emprego de andaimes electrospun dentro do sistema pulmonar tinha até recentemente sido limitada a fins regenerativos; com uma substituição traqueal electrospun ser transplantadas com sucesso. Embora bem sucedido, esses tratamentos são limitados em número, e estão focados em cima da traquéia devido à natureza relativamente simples da função do tecido. Exemplos limitado de modelos de vias aéreas utilizadas para diagnóstico in vitro existem, e estão principalmente concentradas em medições contração do músculo liso,. O não-tóxico e nãopolímero de tereftalato de polietileno n-degradável (PET) foi previamente electrospun, e foi utilizado no presente estudo para garantir andaimes produzidos pode ser armazenada por longos períodos sem degradar (o que lhes permite ser usado "na prateleira"), e também ser adequado para cultura de células estável durante períodos de tempo prolongados. Estudos anteriores de nosso grupo mostraram que o emprego de três variações de um protocolo de electrospinning base, três andaimes electrospun PET individuais podem ser produzidos para fornecer topografias óptimas para a cultura epitelial das vias aéreas, de fibroblastos e células musculares lisas em 21,22 isolamento e a co-cultura das vias aéreas células epiteliais e de fibroblastos 22. Diâmetro da fibra foi encontrado para afectar grandemente funcionalidade epitelial 22, o alinhamento das fibras e permitiu a geração de folhas alinhadas de músculo liso 21. Estes estudos foram realizados de forma independente um do outro, em condições estáticas. No presente estudo, estes differeandaimes nt, contendo as células de seres humanos adultos totalmente diferenciada foram co-cultivadas durante uma semana no ALI num biorreactor disponível comercialmente como uma secção 3D de parede das vias aéreas, proporcionando uma fisiologicamente relevantes no modelo in vitro para investigar as respostas das vias respiratórias inter-celulares. Embora este protocolo está usando o bronchiole das vias aéreas como um sistema modelo, poderia ser adaptado como uma plataforma para a co-cultura 3D de unidades mucosas de outros órgãos.
A capacidade de electrospin fibras poliméricas com propriedades estruturais comparáveis a ECM natural leva a numerosos polímeros naturais ou sintéticos, ou misturas de polímeros que são electrospun para recriar estes ambientes,. Manipulação dos parâmetros do processo (incluindo a escolha do polímero, concentração de polímero, solvente, temperatura e distância da ponta da agulha) todos podem características influência de andaime; no entanto, alguns parâmetros podem ter maior impacto sobre as propriedades de andaime que outros 25,. Ao modificar o diâmetro da fibra de PET, encontramos os parâmetros chave para ser a concentração do polímero utilizado, a taxa em que a solução de polímero foi electrospun, e o diâmetro da agulha. Quando eletrofiação fibras alinhadas aos parâmetros principais são o método de coleta utilizado (um mandril rotativo), e a velocidade com que a rotação do mandril. Através da redução da velocidade de mandril para 60 rpm, encontramos os andaimes alinhadas aleatoriamente produzidos apresentaram maior uni andaimedeformidade em comparação com eletrofiação para um coletor de placa lisa.
As características do tecido descelularizado vias aéreas foram analisados para proporcionar orientação para as diferentes topografias de andaime desenvolvidos para a cultura de cada tipo de células das vias respiratórias. Nanofibras electrospun são um andaime atraente para replicar estruturas de membrana basal, devido ao tamanho de poro pequeno, mas elevada porosidade global que permite o aumento da difusão metabolito mesmo tempo que restringe o movimento celular. 9 Enquanto optimizar os parâmetros de electrospinning, uma gama de concentrações de PET e as taxas de fluxo foram testados. As fibras mais finas foram conseguidos utilizando uma solução de p / vol% de PET 6, previamente utilizado por outros grupos. No entanto, altos níveis de beading, e uma falta de uniformidade foram problemas constantes. As tentativas iniciais para remover a perolização incluído a adição de um agente tensioactivo catiónico, brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB), para a solução para reduzir a tensão de superfície, e teste de várias fontesde PET. A adição de agente tensioactivo reduziu a quantidade de perolização, mas não totalmente. Depois de tentar uma série de fontes comerciais de grãos de PET, alimento bebida grau garrafa PET foi utilizado, cortando-se garrafas de bebidas e dissolver estes no DCM: solução de solvente TFA. Utilizando esta como a fonte de PET resultou num aumento da uniformidade da fibra e uma redução em fibra de perolização. Aumentando a concentração da solução ligeiramente a 8% p / v e a redução do diâmetro da agulha (18G a 23G) que consistentemente produzidos nanofibras livre de defeitos com um diâmetro de fibra de cerca de 250 nm. Andaimes nanofibras electrospun pode ser altamente eletrostática após a recolha do mandril fazendo movimentação manual dos andaimes difíceis. Este foi melhorado, armazenando os andaimes em papel alumínio após fiação e imersão em 70% IMS antes do uso. Este apareceu para ajudar a dissipar a carga eletrostática residual deixado no cadafalso do processo de eletrofiação.
Para fornecer topoographies semelhante aos microambientes individuais encontradas pelos três tipos de células das vias aéreas principais dentro parede das vias aéreas, um protocolo de electrospinning básica foi adaptada para produzir três andaimes exclusivos para estes tipos de células: por eletrofiação uma solução PET baixa concentração lentamente, nanofibras alinhadas aleatoriamente foram gerados, em que as células epiteliais foram semeadas (mimetizando o MAE). Por electrospinning uma solução mais elevada concentração de PET a uma taxa mais rápida, microfibras alinhadas aleatoriamente foram gerados (produzindo um andaime mais porosa), no qual foram semeados fibroblastos (imitando a área da sub-mucosa imediatamente abaixo da RBM). Por electrospinning uma solução de baixa concentração de PET para uma alta velocidade de rotação do mandril alinhado nanofibras foram produzidos, sobre o qual as células de músculo liso orientados na direcção das fibras, produzindo folhas de células alinhadas.
Diâmetros de fibras aumentou a vantagem para o aumento da dimensão dos poros, permitindo maior penetratio celularn em andaimes e assim ajudar a criar um verdadeiro ambiente 3D,. Andaimes microfibra foram empregues para a cultura de fibroblastos no estudo para assegurar que as células residia em planos múltiplos dentro do andaime. Ao aumentar a concentração de PET e 30% em peso / volume, de fibras de PET com um diâmetro médio de 2,5 um foi produzido. Fibras de maior diâmetro (≈ 4 mm) foram produzidas usando uma solução a 35% de PET p / v, mas a uniformidade da espessura de andaime foi perdido, e maior variabilidade entre as fibras individuais era aparente. Poros no andaime de microfibra foram mais de 7 vezes maior do que os medidos nos andaimes de nanofibras (10,45 mm vs 1,43 mm, respectivamente), mas ainda estática semeadura de células fornecida limitada penetração celular. Este foi melhorada por sementeira de forma dinâmica as células usando um misturador orbital, um método demonstrou ser eficaz anteriormente.
Andaimes nanofibras altamente alinhadas foram criados por eletrofiação a 10%em peso / vol solução PET para o mandril em rotação a 2000 rpm (440 ≈ m · min -1). A concentração de PET foi aumentada de 8% para evitar uma morfologia irregular de onda que as fibras expostas a concentrações mais baixas. Apesar do aumento da concentração, o alinhamento das fibras reduziu o diâmetro médio da fibra (216 nm versus 255 nm, alinhadas vs aleatório). A alta velocidade do mandril desenho as fibras para fora antes de terem secado é susceptível de causar este efeito. O alinhamento das fibras influenciado o alinhamento de células ASM, e também tem outros efeitos fisiológicos sobre as células ASM que foram caracterizadas em outra parte 21.
A principal limitação deste protocolo é a incapacidade de células vivas imagem on / nos andaimes que fazem de ligação celular ou diferenciação inicial ao longo de um período de tempo prolongado impossível determinar, sem sacrificar amostras. Isso significa mais de otimização ocorre após o período de cultura, ou seja, corrigiring amostras e depois medir se cultura de células foi bem sucedida depois de não durante a cultura de células. Observando uma mudança de cor em andaimes incubadas em alamarBlue (azul para rosa) indica células estão presentes e viável, mas não é o ideal. Electrospinning polímeros mais transparentes, tais como gelatina pode ajudar a visualizar as células nos andaimes. O electrospinning de um andaime nanofibrous dentro do nosso modelo permitiu a replicação do FRP das vias aéreas, de forma semelhante composto de nanofibras densas em que as células epiteliais residem. Foi previamente demonstrado que as células estruturais não pode migrar através do andaime de nanofibras 22, embora as células imunes são capazes de (dados não mostrados). Embora vantajosa para a cultura de tipos de células específicos sobre uma superfície em 3D (tais como células epiteliais e endoteliais), esta prevenção da migração das células através das nanofibras estrutural pode ser prejudicial para a cultura de outros tipos de células. Como músculo liso é incapaz de migrar através the alinhado nanofibras andaime que montou o co-cultura tri-camadas com o músculo liso e camadas de fibroblastos frente para o outro (oposto ao cadafalso alinhados que separa os dois tipos de células). Enquanto isto permite que as células sejam em estreita justaposição, o presente estudo não pode concluir se um tipo de célula (ou o de fibroblastos ou o músculo liso) ultrapassaria toda a camada ao longo de um período de cultura de mais prolongado. Apesar destas limitações, um modelo tri-camada viável de parede das vias aéreas tem sido desenvolvida que fornece uma plataforma alternativa para investigar as interacções entre estes vários tipos de células. Um estudo semelhante tri-camadas foi recentemente publicado onde fibroblastos foram incorporados dentro de um colagénio cilíndrica eu hidrogel com músculo liso semeados sobre a superfície externa e células epiteliais na superfície luminal 17. A estabilidade mecânica dos andaimes electrospun desenvolvidos aqui permitiria tubular semelhante constrói a ser formada, e mantém-se uma corrente ReseaRCH objetivo dentro do nosso grupo. Enquanto o estudo tem incidido sobre as vias respiratórias, vários órgãos dentro do corpo partes desta unidade estrutural básica da mucosa, e através da modificação dos inquilinos realçado neste estudo, plataformas semelhantes poderia ser desenvolvido para tecidos contendo uma unidade de membrana basal, vasos sanguíneos, incluindo o da bexiga e a córnea, onde modelos baseados em várias camadas de colagénio têm sido utilizados.
The authors have nothing to disclose.
The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement n° 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.
Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
FCS | Gibco | Media supplement | |
Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |