Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.
Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.
Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions4. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry1,11,12.
While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,13 which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,14 which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles15 or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,18-20 these procedures will not be covered here.
We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. 21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,21,24 we will focus mainly on practical concerns.
Prosedyren som presenteres her er en effektiv måte å produsere mikroinjeksjon kanyler og microinjectors som vil hjelpe til å belyse de molekylære substrater for motivert atferd. Denne fremgangsmåte byr på flere fordeler. Først ved produksjon ens egne implantater og microinjectors, nye eksperimentelle parametre kan raskt optimalisert, dvs. en ikke trenger å vente på skreddersydde komponenter for å komme frem. For det andre, på grunn av den lille diameter av kanylen, flere kanyler kan samtidig implantert. Dette forkorter den nødvendige kirurgiske tiden, noe som kan forbedre overlevelsesevne, og også tillater flere implantater per dyr. For det tredje, den programvare som benyttes for å kontrollere driftsavdelingene lett rommer progressive forhold tidsplaner ettersom et fast forhold paradigme hurtig kan omdannes til en progressiv forhold paradigme ved ganske enkelt å bruke et arrangement overgang parameterliste som inneholder den ønskede forsterkning plan.
Å værebredt anvendelige, er en generisk mikroinjeksjon fremgangsmåte presenteres som bør være generelt anvendbar for mikroinjeksjon av nesten en hvilken som helst reagens som for tiden er tilgjengelig. Derfor forventer vi at denne teknikken vil fortsette å være av tilsvarende høy nytte i fremtiden med mindre endring. Ved å endre bare noen variabler kan denne tilnærming brukes til et stort antall reagenser. Parametere som vil oftest manipuleres omfatter den lengden som den microinjector stikker ut fra kanylen, volum av injeksjon, og injeksjonshastigheten. For eksempel kan en ønsker injektoren å stikke ytterligere fra kanylen tips for å unngå glial arr som vanligvis utgjør rundt kroniske implantater. I tillegg kan det være ønskelig å sprøyte inn et større volum. For striatale virus microinjections, blir et volum på 1 mL typisk benyttet, og dette volumet blir vanligvis injisert i løpet av et lengre tidsrom (ofte 7-10 min pluss 3 – 10 min ytterligere diffusjon tid) i forhold til bruksd for farmakologiske reagenser (typisk 0,3 – 0,5 uL mer enn 2 – 3 min pluss 1 – 3 min ekstra diffusjon tid). Brukeren bør konsultere litteraturen og / eller empirisk bestemme parametrene best egnet for deres behov. Uansett, er suksessen til denne prosedyren kritisk avhengig 4 variabler: 1) kanyle lengde, 2) microinjector lengde, 3) kvaliteten på microinjector spray mønster, og 4) systemintegritet før injeksjon. Fordi mikroinjeksjon plassering er avhengig av den dybde som den microinjector stikker ut fra kanylen, er det viktig at begge kanyler (trinn 1.2.8) og microinjector lengde (post-bøying, trinn 2.2.1) er både nøyaktig kjent og ensartet mellom alle fag . Dette kan lett kontrolleres ved lett forkaster enhver redskap som ikke er ønsket lengde ved den endelige re-måling. Dessuten kan injeksjons plassering bare kan forutsies dersom den skjer umiddelbart under lede kanyle. Dermed noen microinjector at does ikke spray en lang, fin strøm ved testing (Steps 2.4.6) bør avvises. En kvalitet injeksjon er også relatert til integriteten til systemet før injeksjon. Hvis du etter utlevering alt vann fra injektoren (før fylling med reagens) flere flekker er observert på lab-tørke, deretter en lekkasje som må utbedres (Merknad om Step 2.4.8). Videre, hvis boble (trinn 2.4.9) som skiller stoffet fra vannet i PE20 rør er ikke en enkelt boble (etter fylling av microinjector med reagens), og injektoren er delvis tilstoppet. Denne tette kan enten forebygge eller avlede injeksjon. Også dette kan lett utbedres (Note på trinn 2.4.8).
Skulle man ønske å microinject mens dyret er i stereotaksisk ramme er det tre alternativer. For det første kan man øke lengden av microinjector kragen slik at den kan holdes fast i stereotaktisk manipulator, og også strekker seg langt nok til å tillate tilkobling til PE20 slange. Sekund, påe kunne timelig implantere en kanyle og bruke standard microinjector presenteres her. Tredje, kan man bruke trukket og polert glass pipetter. 16,17
En betydelig begrensning av fremgangsmåten som presenteres her, er at den utføres best i godt håndtert rotter som er kjent med fremgangsmåten. Rotter som brukes til de dataene som er beskrevet i resultatene delen kreves ingen spesielle håndteringsprosedyrer fordi samme etterforsker håndtert rottene på en daglig basis i over to måneder. Dette omfattet daglig observasjon og manipulering av det kirurgiske implantat i minst 2 uker. Imidlertid kan rotter hurtig tilvendt ved et antall teknikker som brukes til å før pre-puls inhiberingsanalysen, som kan påvirkes av stress. Disse spesielle tilvenning teknikker har blitt pent beskrevet tidligere. 43 I tillegg til disse prosedyrene, er det tilrådelig at rotter bli tilvendt mikroinjeksjon prosedyre hvor forkortede microinjectors brukes during 'humbug' injeksjoner. I løpet av disse simulert injeksjoner, er det avgjørende at microinjector ikke stikker inn i vev for å begrense skade på vev. Med andre ord, bør den microinjector bøyes ikke lenger enn 14 mm. Således kan den grundige tilvenning som kreves for optimal gjennomføring av denne teknikken bli sett på som en begrensning.
Mens flere atferds paradigmer eksisterer for å måle motivasjon, er den progressive forholdet vanligvis brukes til å kvantifisere innsatsen at faget er villig til å øve for å få en forsterker. Den progressive forholdet paradigmet frembringer et mål som kalles brytningspunkt, som ofte er definert som det maksimale antallet håndtakpressinger i den siste fullførte forhold;.. Dvs. maksimal respons som genererte en forsterker 21 den progressive forholdet er følsom for forsterkeren størrelsesorden. For eksempel, høyere kokain (eller sukrose) doser produsere en høyere brytningspunkt og lavere kokain (eller sukrose) doser ga en lavere breakpoint. 21,22 Følgelig er stoppunkt en rutinemessig brukt proxy for motivasjon og / eller forsterkende effekt. 21,23-26 Fordi hensikten med stoppunkt er å bestemme når dyret slutter å svare, en viktig parameter for den progressive forholdet paradigme er innloggingstid. Finite session lengder kan sette en falsk cap på stoppunkt verdier, og dette kan bli forverret av pre-behandlinger som unormalt reduserer frekvensen av selv administrasjon eller som øker etter forsterkning pauser. Dette forvirre kan overvinnes av en rekke tilnærminger.. For eksempel økter som avsluttes når dyret har holdt tilbake reagerer med noen flere av den gjennomsnittlige inter-infusjon intervallet 44 A oftere brukt variant av denne tilnærmingen er å avslutte økter en gang svarer har blitt holdt tilbake av noen empirisk bestemt verdi som holdes konstant på tvers av fag. Vi har gitt den metoden for å bruke denne tilnærmingen i trinn 4.4.9.11.
The authors have nothing to disclose.
MSB is supported by the Alcohol Beverage Medical Research Foundation, a Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), the National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537), and startup funds provided by the Virginia Higher Education Equipment Trust Fund and the VCU School of Medicine.
Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 gauge, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
#7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
Operant Chambers | Coulborun | Habitest |