Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.
Antimikrobiell følsomhetstesting (AST) er utført for å bedømme in vitro-aktiviteten av antimikrobielle midler mot forskjellige bakterier. AST resultater, som uttrykkes som minste hemmende konsentrasjon (MIC) brukes i forskning for antimikrobiell utvikling og oppfølging av resistensutvikling og i klinisk setting for antimikrobiell terapi veiledning. Dalbavancin er en semi-syntetisk lipoglycopeptide antimikrobielle middel som ble godkjent i mai 2014 Food and Drug Administration (FDA) for behandling av akutt bakteriell hud og huden struktur infeksjoner forårsaket av Gram-positive organismer. Fordelen med dalbavancin enn dagens anti-stafylokokk terapi er den lange halveringstiden, som gjør det mulig for en gang ukentlig dosering. Dalbavancin har aktivitet mot Staphylococcus aureus (inkludert både meticillinfølsom S. aureus [MSSA] og meticillinresistente S. aureus [MRSA]), koagulase-negative stafylokokker, <em> Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus gruppe, β-hemolytiske streptokokker og enterokokker vancomycin utsatt. I likhet med andre nyere lipoglycopeptide midler, optimalisering av CLSI og ISO kjøttkraft resistenstestmetoder omfatter anvendelse av dimetylsulfoksid (DMSO) som et oppløsningsmiddel ved fremstilling av stamoppløsninger og polysorbat 80 (P80) for å lindre tilslutning av midlet til plast. Før de kliniske studier, og i løpet av den innledende utvikling av dalbavancin, ble virkningsstudier er ikke utført med bruk av P-80 og MIC-resultatene hadde en tendens til å være 2-4 ganger høyere, og tilsvarende høyere MIC resultater ble oppnådd med agar fortynning mottakelighet metode. Dalbavancin ble først inkludert i CLSI buljong mikrofortynningsplater metodikk bord i 2005 og endret i 2006 for å avklare bruk av DMSO og P-80. Kjøttkraft mikrofortynningsplater (BMD) prosedyren som er vist her er spesifikke for dalbavancin, og er i samsvar med de CLSI og ISO-metoder, med trinn-for-trinn detalj og focoss på de kritiske trinnene lagt for klarhet.
Dalbavancin er en semi-syntetisk lipoglycopeptide som ble godkjent av FDA i mai 2014 ved behandling av akutte bakterielle hud og hud struktur infeksjoner forårsaket av Gram-positive organismer 1. Det primære målet med detaljering denne metoden i et videoformat er å gi klare retningslinjer til de kliniske laboratorier og forskere for testing og rapportering av nøyaktige og reproduserbare dalbavancin resistens mot.
Bestemmelsen av et antimikrobielt middel MIC ved kommersielle fremgangsmåter blir rutinemessig utført i kliniske laboratorier for vurdering av en agent in vitro aktivitet mot patogene bakterier. Metoden som beskrives her er det kokes mikrofortynningsplater metoden som er anbefalt av CLSI og ISO 2,3,4. Siden dalbavancin kommersielle resistens metoder er for øyeblikket ikke tilgjengelig (på tidspunktet for denne publikasjonen) og disk diffusjon og agarfortynnings metoder er for tiden ikke anbefalt feller dalbavancin, referanse buljong fortynningsmetoder er de aktuelle alternativene 12,14. Ettersom dette referansemetode er ikke en kommersiell og FDA ryddet in vitro diagnostiske metoden, kliniske laboratorier i USA som bruker denne fremgangsmåten for pasienten testing må følge regelverket for et laboratorium utviklet test (LDT). Det er forventet at når dalbavancin bruken øker, vil flere laboratorier har behov for å teste denne forbindelse. Vancomycin testing som et surrogat for bestemmelse av dalbavancin mottakeligheten S. aureus har blitt validert 5. Imidlertid kan dalbavancin være aktive mot vancomycin mellom S. aureus (VISA) og derfor kan klinikere be dalbavancin MIC resultater. I tillegg kan det MIC resultater for andre bakterielle arter bli forespurt.
FDA utsatt stoppunkt for dalbavancin mot S. aureus er etablert på ≤0.12 mikrogram / ml. FDA tildelt bare en susceptiold kategori på grunn av manglende data om resistente isolater. Den normale MIC Fordelingen blant villtype S. aureus isolater er mellom 0,03 til 0,12 ug / ml, med en klar modal MIC på 0,06 ug / ml. En liten variasjon i MIC resultater på grunn av metoden forskjell, i tillegg til den iboende BMD variasjon på ± én fortynning, potensielt kan ha en betydelig innvirkning på mottakelighet prisene. 6 I likhet med andre lipoglycopeptide agenter, kan dalbavancin resistenstesting være utfordrende som følge av oppløselighet og den relativt store størrelsen på molekylet og dets bindingsegenskaper 7,8,9. Referanse BMD metoden beskrevet her innbefatter to spesifikke trinn som er unike for uoppløselige stoffer og / eller lipoglycopeptide midler: (1) bruk av DMSO for fremstilling av stamoppløsninger og (2) tilsetning av 0,002% P-80 i den endelige MIC panel fortynninger. Målet med denne videoen publikasjonen er å gi klarhet i dalbavancin BMD metoden og til spesifikasjonlly fokusere på disse viktige skritt, for å sikre nøyaktige og reproduserbare MIC resultater.
Følgende metode detaljer presenteres for ekstra hensyn når du forbereder for dalbavancin MIC testing. Utformingen av MIC panelet vil avhenge av hvor mange antimikrobielle midler som skal testes (ie., Dalbavancin alene eller flere midler) og de arter av bakterier som skal undersøkes. De dalbavancin konsentrasjoner bør omfatte de fortolkende brytningspunkt for alle bakteriearter som skal testes og hele spekteret av fortynninger forventet i minst ett QC belastning. Den antimikrobielle fortynningsserie kan organiseres i rader eller kolonner, avhengig av antall av antimikrobielle midler og / eller isolerer / plate og en fremgangsmåte for inokulering. Volumet av dalbavancin pulver suppen og bør beregnes for å sikre at optimale mengder er produsert og avfall er minimal. For eksempel brukes i denne publikasjonen, er volumene basert på utarbeidelse av to MIC paneler. Kasjon justert Mueller Hinton buljong bør forberedes og autoklaveres i henhold til mannenprodusentens instruksjoner og sterilitet av media bekreftet. MIC paneler kan gjøres og brukes på samme dag i forberedelse eller de kan testes med egnede kvalitetskontrollorganismer og validerte paneler lagret frosset for senere bruk. Det er viktig å anvende sterile teknikker gjennom hele prosedyren.
Det er ingen strenge kriterier for verifikasjon av inoculum konsentrasjon med kimtall. Kimtall kan kontrolleres i utgangspunktet for hver art som ble testet og / eller periodisk for å validere fortynningen utføres i trinn 4,2. Det er viktig at gyldigheten av 0,5 McFarland-standard er også kontrollert rutinemessig med E. coli ATCC 25922 ved hjelp av en prosedyre lignende Trinn 4,5. Hvis resultatene er ikke tilsvarer 1-2 x 10 8 CFU / ml, en ny 0,5 McFarland standard bør innhentes. Dersom kimtall fra MIC brønner er utenfor akseptabelt område (2-8 x 10 5 CFU / ml og MIC resultater for den kliniske isolat (e) varierer fra the forventet normalfordeling (f.eks. 0,03 til 0,12 ug / ml for S. aureus) og / eller MIC resultater for kvalitetskontroll isolat (e) er utenfor forventede områder, er validering testing nødvendig og metode modifisering kan være berettiget. Det er foreslått at en validert 0,5 McFarland-standard anvendes for å gjenta kimtall (e), og hvis resultatet er igjen utenfor forventede resultater, bør inokulumet fortynning som utføres i trinn 4.2 justeres tilsvarende, og MIC gjentas. Merk at en renhet sjekk er nødvendig selv om en kimtall utføres fordi kimtall prosedyren bruker en utvannet volum som kanskje ikke nødvendigvis oppdager lavere konsentrasjoner av forurensende organismer.
For en MIC-test for å være gyldig, må akseptabelt vekst forekommer i vekstkontroll brønnen. For de fleste bakterier som skal testes mot dalbavancin (f.eks., Stafylokokker, streptokokker og enterokokker, veksten vil bli sett på som en knapp (typisk> 2 mm) og mindre frderetter benyttet, kan veksten vises som turbiditet i brønnen. I motsetning til enkelte antimikrobielle midler som kan utvise elegant effekt som konsentrasjoner øke, er dalbavancin endepunkter vanligvis godt definert. Det finnes ulike visnings utstyr som er beregnet for å lette lesing mikrofortynningsplater tester, som kan anvendes til å lese dalbavancin inneholdende platene, så lenge det ikke er noe kompromiss i evnen til å skjelne veksten i brønnene.
De kritiske trinnene i protokollen er knyttet til de delene av den prosedyre som er relatert til oppløseligheten av dalbavancin og tilsetning av P80. Det er viktig at den maksimale konsentrasjon av dalbavancin anvendes ikke er større enn 1600 ug / ml, som DMSO blir benyttet som oppløsningsmiddel og at det mellomliggende konsentrasjoner fremstilles i DMSO før fremstilling av kjøttkraft fortynninger, slik at sluttkonsentrasjonen av DMSO i MIC panel brønner ikke er større enn 1%. DMSO er hygroskopisk og derfor er bruken av eldre flasker DMSO var en consideration med hensyn til dalbavancin oppløselighet. Men mens en liten BMD studie med kvalitetskontroll stammer har vist at dette ikke skal være en viktig variabel (se resultater avsnitt), er det lurt å bruke nye eller nylig åpnede flasker med DMSO. Det er også viktig at P80 tilsettes til kjøttkraft i det siste trinnet av medikament-fortynning preparatet, og er ved en sluttkonsentrasjon på 0,002% i MIC brønnen.
BMD prosedyre inkludert her benytter fremstillingen av MIC-paneler med 50 ul / brønn ved dalbavancin og P-80 konsentrasjoner to ganger den endelige konsentrasjon og tilsetning av inokulum med 50 ul / brønn, slik at sluttvolumet / er vel 100 ul. Denne metoden gjør det mulig for en MIC panel format som skal produseres for testing av både S. aureus og S. pneumoniae fordi lysert hesteblod kan tilsettes til inokulum. Alternative fremgangsmåter for fremstilling av MIC-paneler med 100 ul / brønn med tilsetning av opp til 10 pl / brønn, er beskrevet iCLSI og ISO prosedyrer.
Den dalbavancin utsatt stoppunkt for S. aureus er ≤0.12 mikrogram / ml (FDA i pakningsvedlegget). Som vist i nyere overvåking, er de fleste av isolater hemmet av dalbavancin på nivåer på 0,06 mg / ml 15. Med en mottakelig stoppunkt i nærheten av den modale MIC, kan en hvilken som helst variasjon i MIC som et resultat av metoden forskjeller påvirker mottakelighet priser. På grunn av at fremgangsmåten for BMD dalbavancin inneholder noen unike trinn (nærmere bestemt, ved bruk av DMSO i fremstillingen av lager og mellomliggende medikamentfortynninger og 0,002% P80 i MIC brønnen, er det viktig at fremgangsmåten blir fulgt nøyaktig. S. aureus QC organisme (ATCC 29213) med en veldig klar dalbavancin modal MIC på 0,06 ng / ml, har vært en god indikator på metoden variasjon og bør brukes rutinemessig for å validere BMD metoden. Hvis MIC resultatene er med forventet område av 0,03 til 0,12 mikrogram / ml, men blir Tendens til enten lav eller high side av dette område blir ytterligere validering av metoden berettiget.
Tilsetningen av 0,002% P80 er anbefalt for alle relevante Gram-positive organismer (staphylococcci, enterokokker og streptokokker.) Det er imidlertid bemerkelsesverdig at det har vist seg at lysert hesteblod virker i likhet med P-80 i forhold til sin anti-bindende evne og at tilsetningen av P-80 for å CAMHB + LHB ikke har noen ekstra effekt på dalbavancin streptokokker MIC resultater.
Det er for øyeblikket ingen disk diffusjon metode for testing dalbavancin og på grunn av dårlig korrelasjon av BMD og AD resultater, resistenstesting av dalbavancin bruke AD metoden anbefales ikke 12, 14. Den BMD metoden skal brukes for fremtiden vurdering av dalbavancin mottakelighet og som en gullstandard for utvikling av kommersielle antimikrobielle resistenstester.
The authors have nothing to disclose.
Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.
Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) | VistaLab | Brewster, NY | |
96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16x125mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
12x17mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16 mL centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
Incubator (ambient) | Sanyo | ||
Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
Lab coats |