Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.
Resistensbestämning (AST) utförs för att bedöma aktiviteten av antimikrobiella medel mot olika bakterier in vitro. AST resultat som uttrycks som minsta hämmande koncentrationer (MIC) används i forskning för antimikrobiella utveckling och uppföljning av resistensutveckling och i den kliniska inställningen för antimikrobiell behandling vägledning. Dalbavancin är ett halvsyntetiskt lipoglycopeptide antimikrobiellt medel som godkändes i maj 2014 med Food and Drug Administration (FDA) för behandling av akut bakteriell hud och hud struktur infektioner orsakade av grampositiva organismer. Fördelen med dalbavancin jämfört med nuvarande anti-stafylokock-behandlingar är dess långa halveringstid, vilket gör det möjligt för en gångs skull i veckan dosering. Dalbavancin har aktivitet mot Staphylococcus aureus (innefattande både meticillinkänsliga S.aureus [MSSA] och meticillinresistenta S. aureus [MRSA]), koagulasnegativa stafylokocker, <em> Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus grupp, β-hemolytiska streptokocker och vankomycin känsliga enterokocker. I likhet med andra nyligen lipoglycopeptide medel, optimering av CLSI och ISO buljong mottaglighet testmetoder innefattar användning av dimetylsulfoxid (DMSO) som lösningsmedel vid beredning förrådslösningar och polysorbat 80 (P80) för att lindra vidhäftning av medlet till plast. Innan de kliniska studierna och under den inledande utvecklingen av dalbavancin var känslighetsstudier inte utförts med hjälp av P-80 och MIC resultat tenderade att vara 2-4 gånger högre och på liknande sätt högre MIC resultat erhölls med agar späd känslighet metod. Dalbavancin ingick först i CLSI buljong mikrospädningsmetod tabellerna i 2005 och ändrades 2006 för att klargöra användningen av DMSO och P-80. Buljongen mikrospäd (BMD) proceduren som visas här är specifik för dalbavancin och är i enlighet med CLSI och ISO-metoderna, med steg-för-steg detalj och Fokoss på de kritiska steg lagts till för tydlighetens skull.
Dalbavancin är ett semisyntetiskt lipoglycopeptide som godkändes av FDA maj 2014 för behandling av akut bakteriell hud och hud struktur infektioner orsakade av grampositiva organismer 1. Det primära målet med detaljer denna metod i ett videoformat är att ge tydlig vägledning till de kliniska laboratorier och forskare för testning och rapportering av noggranna och reproducerbara dalbavancin känslighets resultat.
Fastställandet av ett antimikrobiellt medel MIC av kommersiella metoder rutinmässigt i kliniska laboratorier för bedömning av en agents in vitro aktivitet mot patogena bakterier. Den metod som beskrivs här är buljong mikroutspädningsmetoden som rekommenderas av CLSI och ISO 2,3,4. Sedan dalbavancin kommersiella känslighetsmetoderna är inte tillgängliga (vid tidpunkten för denna skrift) och disk diffusion och agar utspädningsmetoder är för närvarande inte rekommenderas feller dalbavancin, referens buljong utspädningsmetoder är de nuvarande alternativen 12,14. Eftersom denna referensmetod är inte en kommersiell och FDA rensas diagnostisk metod in vitro, kliniska laboratorier i USA som använder denna procedur för patienttestning måste följa lagstadgade kraven för ett laboratorium utvecklat test (LDT). Det förväntas att när dalbavancin användningen ökar kommer flera laboratorier har ett behov att testa denna förening. Vankomycin testning såsom ett surrogat för bestämning av dalbavancin mottagligheten hos S. aureus har validerats 5. Emellertid kan dalbavancin vara aktiva mot vankomycin mellanliggande S. aureus (VISA) och kan därför läkare begära dalbavancin MIC resultat. Dessutom kan MIC resultat för andra bakteriearter begäras.
FDA känsliga brytpunkt för dalbavancin mot S. aureus har fastställts till ≤0.12 pg / ml. FDA tilldelas endast en susceptible kategori på grund av bristen på data om resistenta isolat. Den normala MIC fördelningen mellan vildtyp S. aureus isolat är mellan 0,03-0,12 pg / ml, med en tydlig modal MIC på 0,06 mikrogram / ml. En liten variation i MIC resultat på grund av metod skillnad, förutom den inneboende BMD variation på ± en spädning, skulle kunna ha en betydande inverkan på resistenspriser. 6 I likhet med andra lipoglycopeptide medel kan dalbavancin resistensbestämning vara en utmaning som ett resultat av lösligheten och den relativt stora storleken av molekylen och dess bindningsegenskaper 7,8,9. Referens BMD metod som beskrivs här omfattar två specifika åtgärder som är unika för olösliga medel och / eller lipoglycopeptide medel: (1) användning av DMSO för beredning av stamlösningar och (2) tillsats av 0,002% P-80 i den slutliga MIC panelen utspädningar. Syftet med den här videon publikation är att ge klarhet i dalbavancin BMD metoden och specifically fokusera på dessa viktiga steg för att säkerställa noggranna och reproducerbara MIC resultat.
Följande metodinformation presenteras för ytterligare överväganden när de förbereder för dalbavancin MIC-testning. Utformningen av MIC panelen kommer att bero på antalet antimikrobiella medel som skall testas (dvs.., Ensamma eller flera agenter dalbavancin) och de arter av bakterier som skall testas. De dalbavancin koncentrationerna bör omfatta tolknings brytpunkter för alla bakteriearter som skall testas och hela utbud av späd förväntas för åtminstone en QC stam. Det antimikrobiella utspädningsserie kan organiseras antingen i rader eller kolumner beroende på antalet av antimikrobiella medel och / eller isolat / platta och ett förfarande för ympning. Volymen av dalbavancin pulver och buljong ska beräknas för att säkerställa att optimala mängder produceras och avfall är minimal. För exemplet som används i denna publikation, volymerna baserade på framställning av två MIC paneler. Katjon justerat Mueller Hinton buljong bör förberedas och autoklaveras enligt människanfrån tillverkaren instruktioner och sterilitet av medierna kontrolleras. MIC paneler kan göras och användas på samma dag för att förbereda eller så kan testas med lämpliga kvalitetskontroll organismer och validerade panelerna lagrade frysta för framtida bruk. Det är viktigt att använda sterila tekniker under hela förfarandet.
Det finns inga strikta kriterier för kontroll av inokulatkoncentration med kolonier. Kolonier kan kontrolleras initialt för varje testad och / eller med jämna mellanrum för att validera utspädningssteget i steg 4.2 arter. Det är viktigt att giltigheten av 0,5 McFarland standard också kontrolleras rutinmässigt med E. coli ATCC 25.922 användning av ett förfarande liknande steg 4,5. Om resultaten inte motsvarar 1-2 x 10 8 CFU / ml, en ny 0,5 McFarland standard bör erhållas. Om kolonier från MIC brunnar ligger utanför acceptabelt intervall (2-8 x 10 5 CFU / ml och MIC resultat för kliniskt isolat (s) varierar från the förväntade normalfördelning (t ex. 0,03-0,12 pg / ml för S. aureus) och / eller MIC resultat för kvalitetskontroll isolat (s) ligger utanför förväntade intervall, är validering testning behövs och metod modifiering kan vara motiverat. Det föreslås att en validerad 0,5 McFarland standard används för att upprepa mikroorganismer (s) och om resultaten är återigen utanför förväntade resultat, bör ympen utspädning som utförs i steg 4.2 justeras i enlighet och MIC upprepas. Observera att en renhetskontroll är nödvändig även om en mikroorganismer utförs eftersom förfarandet mikroorganismer använder en utspädd volym som inte nödvändigtvis detektera lägre koncentrationer av förorenande organismer.
För en MIC prov skall anses som giltigt måste acceptabel tillväxt ske i tillväxtkontrollbrunnen. För de flesta bakterier som kommer att testas mot dalbavancin (ie., Stafylokocker, streptokocker och enterokocker, tillväxten kommer att ses som en knapp (typiskt> 2 mm) och mindre frequently kan tillväxten visas som grumlighet i brunnen. Till skillnad från vissa antimikrobiella medel som kan uppvisa avslutande effekt som koncentrationer ökar, är dalbavancin endpoints oftast väl definierad. Det finns olika visningsanordningar som är avsedda att underlätta läsningen mikrospädningstest, som kan användas för att läsa dalbavancin innehåller plattor så länge det finns ingen kompromiss i förmågan att urskilja tillväxten i brunnarna.
De kritiska steg inom protokollet är relaterade till de delar av förfarandet som är relaterade till löslighet dalbavancin och tillsats av P80. Det är viktigt att den maximala koncentrationen av dalbavancin användes inte är större än 1600 ^ g / ml, att DMSO används som ett lösningsmedel, och att mellanliggande koncentrationer framställes i DMSO innan du köper buljong utspädningar så att den slutliga koncentrationen av DMSO i MIC panel brunnar inte är större än 1%. DMSO är hygroskopiskt och därför kan användningen av äldre flaskor DMSO var en consideration med avseende på dalbavancin löslighet. Men medan en liten BMD studie med stammar kvalitetskontroll har visat att detta inte vara en viktig variabel (se resultat avsnitt), är det god praxis att använda nya eller nyligen öppnade flaskor DMSO. Det är också viktigt att P80 sättes till buljongen i det slutliga steget av läkemedelsutspädning beredningen och är vid en slutlig koncentration av 0,002% i MIC-brunn.
BMD-förfarandet ingår här utnyttjar framställningen av MIC panelerna med 50 | j, l / brunn vid dalbavancin och P-80 koncentrationer två gånger den slutliga koncentrationen och tillsats av inokulum med 50 | j, l / brunn så att den slutliga volymen / brunn är 100 pl. Denna metod gör det möjligt för en MIC panel format som ska produceras för testning av både S. aureus och S. pneumoniae eftersom den lyserade hästblod kan sättas till inokulat. Alternativa metoder för framställning av MIC paneler med 100 pl / brunn med tillsats av upp till 10 | j, l / brunn beskrivs iCLSI och ISO-förfarandena.
Den dalbavancin mottagliga brytpunkt för S. aureus är ≤0.12 pg / ml (FDA bipacksedeln). Såsom visas i de senaste övervakning, är majoriteten av isolat inhiberas genom dalbavancin vid nivåer av 0,06 | ig / ml 15. Med en mottaglig brytpunkt nära den modala MIC, kan varje variation i MIC som en följd av metod skillnader påverkar resistens priser. Eftersom BMD förfarandet för dalbavancin innehåller några unika steg (närmare bestämt, är användningen av DMSO i beredningen av lager och mellandrogspäd och 0,002% P80 i MIC väl det absolut nödvändigt att metoden exakt följas. S. aureus QC organism (ATCC 29213) med en mycket tydlig dalbavancin modal MIC av 0,06 mikrogram / ml, har varit en bra indikator på metod variation och bör användas rutinmässigt för att validera BMD metoden. Om MIC resultat med det förväntade intervallet 0,03 till 0,12 mikrogram / ml, men är trend till antingen den låga eller high sidan av detta område, är ytterligare validering av metoden befogat.
Tillsatsen av 0,002% P80 rekommenderas för alla relevanta grampositiva organismer (staphylococcci, enterokocker och streptokocker.) Det är dock värt att notera att det har visat sig att lyserade hästblod agerar liknar P-80 i förhållande till dess anti-bindande kapacitet och att tillsatsen av P-80 till CAMHB + LHB har ingen ytterligare effekt på dalbavancin streptokocker MIC resultat.
Det finns för närvarande ingen disk diffusion metod för att testa dalbavancin och på grund av den dåliga korrelationen mellan BMD och AD resultat, resistensbestämning av dalbavancin använder AD metod rekommenderas inte 12, 14. BMD metoden bör användas för den framtida bedömningen av dalbavancin känslighet och som en gyllene standard för utvecklingen av kommersiella antimikrobiella känslighetstester.
The authors have nothing to disclose.
Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.
Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) | VistaLab | Brewster, NY | |
96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16x125mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
12x17mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
16 mL centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
Incubator (ambient) | Sanyo | ||
Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
Lab coats |