Procedura per Decellularization di Rat Livers in un dispositivo di perfusione oscillante pressione
Summary
The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Abstract
Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Introduction
Decellularization e Recellularization possono consentire la generazione di funzionali, organi trapiantabili in vitro 1. By cellule rimozione e materiale antigenico (es., DNA, epitopi alfa-Gal) da un organo, la matrice extracellulare mancato o meno immunogenico (ECM) può essere ottenuto. Questa matrice conserva microanatomia tridimensionale di un organo e può servire come biomatrice ideale per ripopolamento con cellule di un differente, origine eventualmente xenogenico 2. Così, un ratto di matrice fegato decellularized potrebbe essere ripopolata con le cellule di fegato umano. Questo umanizzato micro-fegato potrebbe servire come modello ex vivo per la ricerca sulle malattie (ad es., Le malattie metaboliche congenite, malattie virali o tumori maligni) o per test farmaceutici preclinici 3.
Diversi protocolli diversi per fegato di ratto perfusione decellularization sono già stati pubblicati 4-13. In tutti i protocolli, decellularzione è stato ottenuto mediante perfusione di detergenti ionici o non ionici alcaline tramite la vena porta cannulata. Per quanto a nostra conoscenza, siamo stati il primo gruppo a riferire di ratto decellularization fegato perfusione selettiva attraverso la vena porta e / o il ratto arteria epatica 14. Attivazione della perfusione selettiva dei diversi sistemi vascolari nel fegato può consentire migliori risultati Decellularization e, inoltre, può giocare un ruolo importante nel ripopolamento cellulare.
Nello studio qui descritto, fegati sono stati perfusi in un dispositivo di perfusione di proprietà su misura, consentendo di perfusione in condizioni di pressione oscillanti. Queste condizioni di pressione imitano la perfusione respiratorie dipendente fisiologica del fegato: in situ, fegato pende sotto la copula del diaframma, il cui movimento durante la respirazione ha un impatto diretto sulla perfusione del fegato. Inspiration conduce specificamente abbassamento del diaframma e spremitura del fegato, ottimizzandoepato-deflusso venoso, che conduce alla scadenza elevazione del fegato e abbassamento della pressione intraddominale ottimizzare afflusso portale-venosa 15.
Il nostro obiettivo era quello di valutare se le condizioni di pressione oscillanti hanno un impatto sulla omogeneità del fegato di ratto perfusione decellularization imitando condizioni intraabdominal ex vivo. L'omogeneità del processo decellularization può essere un fattore sottovalutato perfusione decellularization. Tutti gli agenti noti utilizzati per decellularization fegato causa alterazioni della ECM. Le cellule in zone poco irrorate rimangono all'interno della ECM, mentre altre zone sono già completamente decellularized. Per sciogliere le cellule rimanenti, la durata di perfusione o pressione devono essere elevate, causando più alterazioni alle aree ben irrorate-. Così, detergenti per decellularization devono essere distribuiti in modo omogeneo all'interno dell'organo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se la tecnica presentata per la raccolta del fegato di ratto e decellularization è facilmente riproducibile, ci sono alcuni passaggi critici da considerare:
Durante la preparazione per la raccolta del fegato, è importante evitare emorragia grave perché attiverà la coagulazione del sangue e può portare alla formazione di coaguli di sangue all'interno del fegato. A nostro avviso, è vantaggioso incidere aorta addominale direttamente prima incannulazione della vena porta per evit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens and Katharina Struecker for their help during this project.
Materials
| Self built arterial cannula | |||
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/100 | 0,28mm ID 0,61mm OD |
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/200 | 0,58mm ID 0,96m OD |
| Venodrop Safe butterfly catheter | Fresenius Kabi | 3275851 | 21 G |
| portal vein cannula | |||
| Periphereal Venous Catheter | BD | 393224 | BD Venflon Pro 20G |
| three-way stopcock | smiths medical | 888-101RE | |
| surgery | |||
| Cotton Sticks | Hecht-Assistent | 4302 | |
| Cotton Pads | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | 13H118-03 | |
| Gauze Bandage | Hubei Haige Medical Instruments | 14388 | |
| Ringer Solution | Fresenius Kabi | 13 HKP022 | 1000ml |
| 10ml Syringe | Braun | 4606108V | 10ml/ Luer Solo |
| 5ml Syringe | Braun | 4606061V | 5ml /Luer Solo |
| Suture (Silk 6/0) | Resorba | H1F | LOT 105001.81 |
| medical drape | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | D0613011 | |
| surgical instruments | |||
| needle holder | Geuder | 17570 | |
| micro-forceps | Inox-Electronic | 91150-20 | |
| micro-scissors | Martin | 11-740-11 | |
| micro-forceps | S&T | 112314 | |
| Clamp | Aesculap | BH111R | |
| scissors | F S T | 14501-14 | |
| surgical forceps | Aesculap | BD 557 | |
| Decellularisation | |||
| Respirator | Resmed | 14.24.11.0004 | SmartAIR ST |
| Perfusion Device | Charite, medical engineering laboratory | custome-made device | decellularisation device |
| peristaltic pump ismatec reglo ICC | IDEX | ISM4408 | 4-channel |
| heidelberger extension 75 cm | Fresenius Kabi | 2873 | 75 cm |
| MS/CA pump-segment | IDEX | IS 3510 | MS/CA/click'n'go/POM-C |
| CA 2-stopper tube | Pharmed | BPT NSF-51 | |
| bubble trap | custome-made item | ||
| Luer Lock hose connector | Neolab | No. 02-1887 | |
| Detergents | |||
| SDS pellets | Carl Roth | CN30.4 | 2,5 kg |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.1 | 10l |
| PBS | Gibco | 14190-094 | DPBS |
| staining | |||
| Eosin 1% | Morphisto | 10177 | |
| Mayer hematoxylin | AppliChem | A4840 | |
| gomori staining | Morphisto | 11104 | |
| AlcainBlue-PAS staining | Morphisto | 11388 | |
| Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 |
Referências
- Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Wang, X., et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16, 814-820 (2010).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).
- De Kock, J., et al. Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool. Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).
- Park, K. M., Woo, H. M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).
- Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering. J Biosci Bioeng. , (2012).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver Int. 33, 448-458 (2013).
- Struecker, B., et al. Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Struecker, B., et al. Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
