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Implementando Grampo patch e ao vivo microscopia de fluorescência para monitorar propriedades funcionais de recentemente isolados PKD Epithelium

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DOI:

10.3791/53035

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1 de setembro de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

Neste artigo

Resumo

Canais de iões expressas em epitélio tubular renal, desempenha um papel significativo na patologia da doença poliquística do rim. Aqui nós descrevemos protocolos experimentais utilizados para a realização de análises e medições de nível de cálcio intracelular de patch-clamp no epitélio cístico recentemente isoladas de rins de roedores.

Resumo

Iniciação cisto e expansão durante a doença renal policística é um processo complexo, caracterizado por anormalidades na proliferação celular tubular, acúmulo de líquido luminal e formação de matriz extracelular. Atividade de canais iônicos e sinalização intracelular de cálcio são parâmetros fisiológicos fundamentais que determinam funções do epitélio tubular. Foi desenvolvido um método adequado para observação em tempo real da actividade de canais de iões com a técnica de patch-clamp e registo de Ca2 + intracelular em monocamadas epiteliais nível isolados de fresco a partir de quistos renais. PCK ratos, um modelo genético de doença renal policística autossômica recessiva (DRPAR), foram usados ​​aqui para ex vivo análise de canais iônicos e fluxo de cálcio. Aqui descrito é um procedimento detalhado passo-a-passo projetado para isolar monocamadas cística e túbulos não dilatado de PCK ou ratos normais Sprague Dawley (SD), e monitorar a atividade de canal único e de Ca 2+ intracelular dinâmica.Este método não exige processamento enzimático e permite a análise de uma configuração nativa isolada de fresco de monocamada epitelial. Além disso, esta técnica é muito sensível a alterações de cálcio intracelular e gera imagens de alta resolução para medições precisas. Finalmente, isolado epitélio cística pode ser ainda utilizado para a coloração com anticorpos ou corantes, preparação de culturas primárias e purificação por vários ensaios bioquímicos.

Introdução

Canais de iões desempenhar um papel importante em muitas funções fisiológicas, incluindo crescimento e diferenciação celular. Doenças policística dominante autossómica recessiva e nos rins (ADPKD e ARPKD, respectivamente) são doenças genéticas caracterizadas pelo desenvolvimento de quistos renais cheios de fluido da origem nas células epiteliais tubulares. ADPKD é causada por mutações de genes PKD1 ou PKD2 codificam polycystins 1 e 2, proteínas de membrana envolvidas na regulação da proliferação e diferenciação celular. PKD2, por si só ou como um complexo com PKD1, também funcionar como um catião de Ca2 + -permeable canal 1. As mutações do gene que codifica PKHD1 fibrocystin (uma proteína do tipo receptor-associado cílios envolvidos na tubulogenesis e / ou manutenção da polaridade do epitélio) são o impulso genética da ARPKD 2. Crescimento do cisto é um fenômeno complexo, acompanhado de proliferação perturbado 3,4, angiogênese 5, desdiferenciação e perda de polardade de células tubulares 6-8.

Reabsorção defeituoso e secreção aumentada no epitélio cístico contribuir para o acúmulo de líquido no lúmen e cisto expansão 9,10. Fluxo-dependente prejudicada [Ca2 +] i sinalização também tem sido associada a cistogénese durante PKD 11-15.

Aqui, nós descrevemos um método adequado para medições de patch-clamp da actividade do canal único e níveis intracelulares de Ca 2+ em monocamadas epiteliais císticas isolados de ratos PCK. Este método foi aplicado com sucesso por nós para caracterizar de actividade do canal de Na + epitelial (ENaC) e 10 [Ca 2+] i induzidas por processos dependentes de Ca 2+ e TRPV4 -permeable purinérgico cascata de sinalização 13.

Nestes estudos utilizou-se ratos PCK, um modelo de ARPKD causada por uma mutação espontânea no gene PKHD1. A cepa PCK foi originally derivada a partir de ratos 16 ratos SD, assim, são utilizados como um controlo apropriado para comparação com a estirpe PCK Sprague-Dawley (SD). Como resultado, ambos os segmentos dos néfrons de ratos SD e dutos não dilatado coleta isolados de ratos mesmas PCK pode servir como dois grupos de comparação diferentes para fazer experimentos sobre epitélio cística.

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Protocolo

Os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional no Medical College of Wisconsin e University of Health Science Center Texas em Houston e estavam de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A Figura 1 demonstra os passos principais do processo de isolamento e processamento do tecido. Resumidamente, os rins de ratos SD ou PCK são utilizados para o isolamento manual das monocamadas epiteliais de recolha de condutas, quer a partir de túbulos ou cistos não-marcado saudáveis. Aqui nós estudados rins de 4-16 semanas de idade ratos PCK 10,13.

1. Isolamento de renais Cistos e Palhinha Conexão (CNT) / ductos coletores (CD) Segmentos

  1. Anestesiar animal experimental com isoflurano (5% de indução, de 1,5 a 2,5% de manutenção) / Medical Grade O 2 ou outro método aprovado. Os animais devem ser continuamente monitorado para garantir le adequadavel da anestesia. Reação taxa e toe pitada respiratório estável são utilizados para confirmar a anestesia adequada.
  2. Execute laparotomia e liberar os rins com tampão fosfato salino (PBS) através da aorta abdominal 17.
    1. Prepare um cateter tubo de polietileno (PE50) e conectá-lo a uma bomba de seringa preenchida com PBS. Corte a pele e parede abdominal ao longo da linha alba, em seguida, fazer uma incisão abdominal transversa através do abdômen de lado a lado e deslocar os órgãos abdominais com cotonetes para obter o acesso à aorta descendente com ramificações mesentéricas e celíacas artérias. Umedeça os órgãos internos com solução salina quente durante procedimentos adicionais para impedir a sua secura.
    2. Coloque uma ligadura (# 1) em torno das artérias mesentéricas e celíacas e outra ligadura (# 2) em torno da aorta sob o diafragma (não amarrar). Delicadamente separar a. abdominalis por Blunt dissecar os tecidos conectivos em torno dela com uma pinça fina e colocar duas ligaduras ~ 3mm abaixo da artéria renal esquerda (# 3) e acima da bifurcação artérias ilíacas (# 4).
    3. Amarre ligadura # 4 e anexar uma braçadeira navio ao redor da aorta, entre a artéria renal esquerda e ligadura # 3. Faça uma incisão entre o grampo e ligadura # 4 a cateterização da aorta, use ligadura # 3 para fixar firmemente o cateter.
    4. Solte a braçadeira e certifique-se que o pulso de sangue é visível no cateter para garantir a instalação adequada. Comece a perfusão a um caudal de 6 ml / min, o laço ligaduras # 1 e # 2, e cortar a veia renal esquerda. Continue lavando por 1-2 min até que os órgãos estão completamente empalideceu.
    5. Corte vasos sanguíneos renais, uretra e que cercam tecidos conjuntivos e adiposas com uma tesoura para recolher os rins. Em seguida, faça uma pequena lágrima em cápsula renal e descasque os rins a decapsulate-los. Colocar os rins em PBS gelado. Eutanásia é confirmada através de uma toracotomia.
  3. Prepare 5 x 5 mm chips de vidro de cobertura revestidas com poli-L-lisina. Corte uma tampa glass com um lápis e diamante lugar aproximadamente 20 ul de solução esterilizada por filtração de poli-L-lisina em cada chip de vidro de 0,01%. Prepare salina e duas pinças de relojoeiro para dissecção.
  4. Cortar os rins com uma lâmina de barbear ao longo do plano frontal em fatias de ~ 1-2 mm de espessura. Coloque uma das fatias sob um microscópio estereoscópico. Isolamento de tecidos deve ser feito em solução salina gelada.
  5. Localize cistos sob microscópio estereoscópico como cavidades em forma redonda (Figura 2A); suas paredes contêm frequentemente proeminente rede de vasos sanguíneos proliferaram. Utilizando uma pinça de ponta fina dissecar a camada epitelial interno de um quisto tão fino quanto possível para obter uma área de monocamada. Una-o a um chip de vidro cobertos com poli-L-lisina. Pegajosa superfície Poli-L-Lisina permite ao pesquisador posicionar firmemente a camada interna cisto no vidro. Exponha o cisto com o lado apical para fornecer acesso para as pipetas (Figura 2B).
  6. Use PCK ou SD rato criançafatias centrais ney contendo papila para o isolamento de não dilatados CNT / CCDsegments 18-21.
    NOTA: tecidos papilares são mais duráveis ​​do córtex e segurando faixas tubulares papilar, com uma pinça e rasgando ao longo eixo radial a fatia pode ser clivada em setores finas. Túbulos individuais são visíveis e podem ser puxado para fora para ser colocado em chips de vidro capa.
  7. Identificar os segmentos CNT / CCD por bifurcações, maior transparência do que túbulos proximais e células proeminentemente visíveis grandes (Figura 2C). Coloque o chip de vidro com tampa túbulos anexados sob um microscópio equipado com micromanipuladores adequadas para micropipetas condução. Usando micropipetas afiadas túbulos split-abertos e anexar suas bordas ao vidro para tornar a superfície apical acessível (Figura 2D).

Eletrofisiologia 2. Single Canal patch-clamp

  1. Encha a câmara de patch-clamp com solução de banho e transfira o chip tampa de vidrocom tecidos isolados para a câmara. Certifique-se de que as micropipetas de patch-clamp têm resistência de 10/07 mohms para medições confiáveis ​​sobre células-anexado (celulares).
  2. Para as medições ligado de células, definir a relação de ganho do amplificador de 20x e de baixo passar as correntes em 300 Hz por um filtro de oito pólos Bessel. Para a monitorização canais ENaC, usar uma solução de banho, em mM: NaCl 150, CaCl2 1, MgCl2 2, 10 HEPES (pH 7,4); pipeta: 140 LiCl, 2 de MgCl2 e 10 HEPES (pH 7,4).
  3. Realizar um experimento patch-clamp convencional em um modo ligado à célula 10. Seleccionar uma célula na monocamada epitelial e aproximar a pipeta para a membrana apical. Formar uma vedação de alta resistência entre uma pipeta e membrana celular através da aplicação de sucção suave. Uma vez que um selo gigaohm resistente de alta é formado, um protocolo livre de gap em um potencial de realização deve ser iniciado para a atividade de monitoramento do canal de interesse.
  4. Loja gap-livres únicos dados atuais do canal de gigaSelos Ohm para análise posterior. Analisar os eventos de canal utilizando um pacote de software geralmente fornecidos com configurações de patch-clamp 18. Calcular a actividade de canal como npo em que N se refere ao número de canais activos na amostra e P é o probabilidade média aberta dos canais.
    NOTA: Use cistos isolados ou túbulos em experimentos de patch-clamp para não mais de 30 min.

3. Raciometrico epifluorescência Medidas de intracelular concentração de cálcio nas células epiteliais

  1. Use 5 mM Fura-02:00 dissolvido em DMSO. Solução estoque alíquota em 500 mL tubos cônicos individuais (cerca de 10 mL). Proteger da luz e armazenar no congelador a -20 ° C por até seis meses.
  2. Incubar cistos isolados e túbulos dividir-aberto para 30-40 min no PSS (em mM: NaCl 145, KCl 4,5, 2 MgCl2, CaCl2 2 e 10 HEPES a pH 7,35) contendo 5 mM Fura-02:00 corante e 0.05% de ácido plurónico para ajudar a dispersar os ésteres de acetoximetilo. Para que, no lugar dos tecidos 3,5 cm de placa de carregamento cocktail contendo, proteger da luz e incubar num agitador lento à temperatura ambiente.
  3. Mudar Fura-2 AM contendo meios para limpar PSS após incubação e colocar o tecido sob um microscópio para executar mais imagiologia de epifluorescência.
  4. Ligue câmara CCD e fonte de luz estável (sistema de monocromador) equipado com roda de filtro (cada posição do filtro pode ser associado com o seu próprio nível de atenuação, seleccionado cada vez que o filtro é chamado).
  5. Encontre o tecido no campo brilhante. Mudar para detecção do sinal de fluorescência e ajustar a intensidade da fonte de luz usando filtros de densidade neutra e potência da lâmpada para evitar a saturação do sinal.
  6. Monitorar Fura-2 AM de fluorescência na amostra de tecido com excitação a 340/380 nm raciométrica com uma frequência de 0,125 Hz ou superior. Use um / NA 1.3 ou similar lente objetiva de 40 × para resolu adequadação imagem.
  7. Para o processamento e cálculos imagem importar a seqüência de imagens. Certifique-se de dividir os canais e usar um modo hyperstack em tons de cinza. Seleccione várias regiões de interesse (células únicas quisto ou áreas seleccionadas de tecido cístico) e o cálculo dos valores de intensidade para cada um dos canais (340 e 380 nm) para o software de análise de dados preferido; valores de intensidade fundo subtrair de cada ponto de dados.
  8. Para cada ponto de tempo de calcular a relação entre as intensidades de Fura-2 AM 340 a 380 canais. Gráfico de dispersão / linha mudanças em tempo ponto de Ca 2+ transitória para cada região e calcular valores médios / SE.

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Resultados

Potencial envolvimento ENaC em cistogénese tem sido demonstrada em vários estudos que observadas factor de crescimento epidérmico interrompido (FEG) de sinalização na progressão de PKD 22-25 e a reabsorção de sódio anormal na ARPKD modelos murinos e de culturas de tecidos 26-28. Por exemplo, Veizis et al. Mostraram que a absorção sensíveis ao amiloride Na + é diminuída em células CD a partir do modelo não-ortólogas rato BPK de ARPKD 29. Nós demonstramos recentemente q...

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Discussão

Descrevemos aqui aplicações da técnica de patch-clamp convencional e imagiologia de epifluorescência cálcio para monocamadas epiteliais císticas derivados de um modelo murino de ARPKD genética. O protocolo consiste em três etapas, das quais a maior atenção deve ser dada ao isolamento dos cistos (passo 1.5 da seção de protocolos) e aos estudos eletrofisiológicos. Estes procedimentos fundamentais requerem treinamento extenso e paciência, eo leitor não deve ser frustrado ao mesmo tempo.

Primeir...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) para assistência técnica excelente, com experimentos de microscopia. Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 HL108880 (a AS), R01 DK095029 (para OPO) e K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (para OPO) e o Ben J. Lipps Research Fellowship da Sociedade Americana de Nefrologia (para DVI).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fura-2 AMLife TechnologiesF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
Poli-L-lisinaSigma-AldrichP4707
Ácido plurônicoSigma-AldrichF-68 solução
ShakerBoekel Scientific260350
Fonte de luzSutter Instrument CoLambda XLcom obturador/filtro integrado
Filtros de densidade neutraNikonND4, ND8
ObjectiveNikonSFluo 40/1.3 DIC WD 0.22    óleo
CâmeraAndor TechnologiesZyla sCMOS
Microscópio Nikon  (invertido)NikonNikon Eclipse TE2000-S
Tampa de VidroThermo Scientific6661B52
Lápis de diamanteFisher Scientific22268912
Software de aquisição de imagemNikonNikon NIS-Elements 
Software de análise de imagemOImageJ http://imagej.nih.gov/ND Utility permite importar imagens no formato nativo da Nikon Instruments .nd2
Câmara de gravação/perfusãoWarner InstrumentsRC-26
Patch Clamp amplificadorMolecular DevicesMultiClamp 700B
Sistemade Aquisição de DadosDispositivos MolecularesDigidata 1440AAxônio Digidata® Sistema
de filtro passa-baixoWarner InstrumentsLPF-88 pólos Bessel
Borosilicato capilares de vidro ExtratorSutter
Instrument CoP-97Extrator de micropipeta tipo flamejante / marrom
MicroforgeNarishigeMF-830Japão
MicromanipuladormotorizadoSutter Instrument CoMP-225
Microscópio invertidoNikonEclipse Ti
Mesa de isolamento de microvibraçãoTMCequipada com gaiola de Faraday
Sistema de perfusão de válvula multicanalAutoMake ScientificValve Bank II
Câmara de gravação/perfusãoWarner InstrumentsRC-26
SoftwarepClamp 10 . 2Molecular Devices
Núcleopara roedores
Estereomicroscópio binocularNikonSMZ745
Sistema de perfusão baseado em bomba de seringaHarvard Apparatus
Anestesia
isofluoranahttp://www.vetequip.com/>911103
Outros reagentes básicosSigma-Aldrich
plugin de micropipeta Mesa cirúrgica controlada por temperatura da MCW Tubo de polietileno

Referências

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