Este protocolo descreve um método para a fabricação de nanopartículas poliméricas condutoras misturadas com fulereno. Essas nanopartículas foram investigadas quanto ao seu potencial uso como fotossensibilizadores de próxima geração para Terapia Fotodinâmica (PDT).
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Artigo de método
Terapia Fotodinâmica com Blended polímero condutor / Fullerene Nanoparticle Fotossensibilizadores
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste artigo, é relatado um método para a fabricação e avaliação in vitro reprodutível de nanopartículas poliméricas condutoras misturadas com fulereno como os fotossensibilizadores de próxima geração para Terapia Fotodinâmica (PDT). As nanopartículas são formadas pela interação hidrofóbica do polímero semicondutor MEH-PPV (poli[2-metoxi-5-(2-etilhexiloxi)-1,4-fenilenovinileno]) com o fulereno PCBM (éster metílico do ácido fenil-C 61-butírico) na presença de um solvente não compatível. O MEH-PPV tem um alto coeficiente de extinção que leva a altas taxas de formação de tripletos e carga eficiente e transferência de energia para o PCBM de fulereno. Os últimos processos aumentam a eficiência do sistema PDT por meio da formação de tripletos e radicais assistidos por fulereno e desativação ultrarrápida de MEH-PPV excitado. Os resultados aqui relatados mostram que este sistema de sensibilização de nanopartículas PDT é altamente eficaz e mostra especificidade inesperada para linhagens de células cancerígenas.
Introdução
Em Terapia Fotodinâmica (PDT) fotossensibilizantes são administrados para atingir o tecido, e após a exposição à luz do fotossensibilizador gera espécies reativas de oxigênio (ROS). ROS espécies, tais como oxigénio atómico e superóxido pode induzir estresse oxidativo e danos estruturais após a células e tecidos 1-4. Devido à sua facilidade de aplicação desse método tem sido activamente investigados e ensaios clínicos foram realizados 5,6. No entanto, os problemas significativos tais como toxicidade no escuro dos sensibilizadores, a sensibilidade do doente a luz (devido a uma distribuição não selectiva do sensibilizador), e hidrofobicidade dos se....
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Protocolo
1. Cultivar Linhas Celulares
- Thaw TE 71 (células epiteliais do timo mouse), MDA-MB-231 (células de câncer de mama humano), A549 (células de câncer de pulmão humano) e OVCAR3 (células de tumor do ovário humano) segurando os frascos criogênica em água morna por menos de 2 min . Adicionar 10 ml de meio DMEM suplementado com FBS a 10% para cada linha celular e centrifuga-se durante 6 min a 106 x g.
- Aspirar a suspensão de 3 ml e adicionar meios para o sedimento. Misturar as células por pipetagem adequadamente várias vezes. Adicionar esta solução de células de pré-aquecida até 7 ml de meio DMEM suplementado com 10% de FBS em frascos T75 e manter os fra....
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Resultados
Absorção e citotoxicidade intrínseca de nanopartículas
Os 50% em peso de nanopartículas misturados MEH-PPV / PCBM foram incubadas com TE 71, MDA-MB-231, A549 e linhas de células OVCAR3. O nível PCBM mistura foi escolhido como 50% em peso PCBM, o que foi mostrado para fornecer propriedades de carga e de transferência de energia ideal entre polímeros e conjugados fulerenos 14. As imagens de fluorescência de absorção de nanopartículas estão apresentados na Figura
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Discussão
Para conseguir a absorção de nanopartículas, foi necessário manter algumas medidas críticas enquanto a fabricação das nanopartículas. Uma solução de M MEH-PPV 10 -6 (misturado com 50% em peso PCBM) em THF foi preparada para injectar água Dl, uma vez que foi observado que a concentração desta solução desempenha um papel importante na determinação do tamanho das nanopartículas sendo formada. A concentração foi verificada por espectroscopia de Uv-vis. Note-se que no passo 2.1.3 protocolo foi necessário diluir a .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem à National Science Foundation (NSF) pelo apoio financeiro a este trabalho por meio de um prêmio CAREER (CBET-0746210) e por meio do prêmio CBET-1159500. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Turkson (Univ. do Hawaii Cancer Center) e ao Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) pela assistência com a cultura de células.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Poli[2-metoxi-5-(2-etilhexiloxi)-1,4-fenilenovinileno] (MEH-PPV) | Sigma Aidrich | 536512-1G | média Mn 150.000-250.000 |
| [6,6]-fenil C61 éster metílico de ácido butírico (PCBM) | Sigma Aidrich | 684449-500MG | 99,5% |
| Tetrahidrofurano (THF) | EMD | TX0284-6 | Seringa Drisolv |
| de 1 ml | Científica Nacional | 37510-1 | Para filtração de solução MEH-PPV |
| Filtro de seringa | VWR | 28145-495 | 25 mm, 0,2 µ m, |
| seringa de PTFE 1 ml | Hamilton Company | 81320 | Para injeção de solução MEH-PPV em água para fazer nanopartículas |
| Modificação de Dulbecco do Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM) | Corning (VWR) | 45000-350 | |
| Solução salina balanceada de Hank sem vermelho de fenol (HBSS) | Quality Biological (VWR) | 10128-740 | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, 1x sem cálcio e magnésio (DPBS) | Corning (VWR) | 45000-436 | |
| Soro fetal bovino, regular (inativado pelo calor) (FBS) | Corning (VWR) | 45000-736 | |
| Tripsina EDTA 1x 0,25% | Corning (VWR) | 45000-664 | Tripsina/2,21 mM EDTA em HBSS sem bicarbonato de sódio, cálcio e magnésio Parvovírus suíno testado |
| 16% Paraformaldeído | Ciências da Microscopia Eletrônica | 15710 | O paraformaldeído a 16% é diluído a 4% pela adição de PBS |
| DAPI | Biotium VWR | 89139-054 | Coloração nuclear |
| Pipetas de 5 ml | VWR | 82050-478 | |
| Balão de cultura de 75 cm2 | VWR | 82050-856 | para cultura |
| de células Placas de 96 poços | VWR | 82050-771 | para ensaios MTT |
| Placas de cultura de tecidos com aberturas | Greiner Bio-One (VWR) | 82050-538 | |
| Iodeto de propídio | Sondas moleculares | P3566 | |
| Anexina V FITC | Invitrogen | A13199 | corante para apoptose |
| Celltiter 96 ensaios não-R 1000 | Promega (VWR) | PAG4000 | MTT |
| CellROX Green Reagent, para detecção de estresse oxidativo | Invitrogen | C10444 | para ROS |
| espectrômetro UV-vis | Agilent 8453 | ||
| Espectrômetro de fluorescência | NanoLog HoribaJobin Yvon | ||
| PD2000DLS de espalhamento de luz dinâmico | , detector | ||
| Incubadora | NuAir DH Autoflow | ||
| Microscópio confocal | Zeiss Axioskop2 | 63X lente objetiva de imersão em óleo | |
| Microscópio de epiluminescência | Olympus IX71 | 60X lente objetiva de imersão em água, câmera Andor Zyla sCMOS | |
| Simulador Solar | Newport 67005 Oriel Instruments | ||
| Referência célula solar | Oriel | Os padrões de VLSI incorporaram | |
| hemocitômetro | Hausser Scientific Partnership | 3200 | |
| Microplate |
Referências
- Dolmans, D., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. J Natl Cancer Inst. 90 (12), 889-905 (1998).
- Ferrari, M.
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Reimpressões e permissões
