This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.
Den extracellulära matrix (ECM) är en komplex nätverket av tvärbundna proteiner som ger biofysikaliska och biokemiska signaler som är viktiga regulatorer av celltillväxt, överlevnad, migration, etc. ECM spelar en viktig roll i utvecklingen och i olika sjukdomar, inklusive hjärt-kärl och muskuloskeletala sjukdomar, fibros och cancer. Sålunda kunde karakterisera sammansättningen av ECM för normala och sjuka vävnader leda till identifiering av nya prognostiska och diagnostiska biomarkörer och potentiella nya terapeutiska mål. Men har mycket karaktär ECM-proteiner (stora storlek, tvärbundna och kovalent bundna, tungt glykosylerade) återges biokemiska analyser av ECM utmanande. För att övervinna denna utmaning har vi utvecklat en metod för att berika ECM från färska eller frysta vävnader och tumörer som drar nytta av olöslighet ECM-proteiner. Vi beskriver här i detalj decellularisering förfarande som består av sekventiellt incubations i buffertar med olika pH och salt och tvättmedelskoncentrationer och som resulterar i 1) utvinning av intracellulära (cytosoliskt, kärnkraft, membran och cytoskeletal) proteiner och 2) anrikning av ECM-proteiner. Vi beskriver sedan hur man deglycosylate och smälta ECM berikad proteinpreparat till peptider för efterföljande analys genom masspektrometri.
Den extracellulära matrix (ECM) är en komplex nätverket av tvärbunden och glykosylerade proteiner som ger arkitektonisk stöd och förankring för celler och definieras delvis, vävnader "biomekaniska egenskaper 1,2. ECM-proteiner signalerar också till cellerna antingen direkt genom deras receptorer (t.ex. integriner, syndecans, etc.) eller genom att modulera tillväxtfaktor signalering 3. ECM tillhandahåller således biofysikaliska och biokemiska signaler som är stora regulatorer för cellulära processer såsom proliferation, överlevnad, polarisation, differentiering, migration, etc.
ECM spelar nyckelroller i fysiologi, utveckling och åldrande 4. Dessutom är flera sjukdomar, såsom hjärt-kärlsjukdomar, fibros, muskel- och skelettsjukdomar, cancer, som orsakas av, eller resultera i, ECM förändringar. Dessutom bidrar ECM till upprätthållandet av stamcells nischer och identifiera viktiga ECM-molekyler thpå stöd stemness kommer att ha direkt tillämpning i tissue engineering och regenerativ medicin 5. Men trots dess betydelse har ECM kvar, tills nyligen, underexplored 6.
I silico analys har visat att matrisome, definierad som ensemble av ECM och ECM-associerade proteiner, omfattar produkterna från flera hundra gener i både mänskliga och mus genomen 1,7,8. Emellertid har olöslighet av ECM-proteiner hindras systematisk karaktärisering av kompositionen in vivo extracellulära matriser av normala och patologiska prov. Vi visade nyligen att denna olöslighet kan vändas till en fördel och kan användas för att berika ECM-proteiner 8 – 10. Vi och andra visade vidare att masspektrometri var en metod för val för att karakterisera sammansättningen av ECM 8 – 10, 13.
Vibeskriver här en decellularisering förfarande som består av sekventiella inkubationer i buffertar med olika pH och salt och tvättmedelskoncentrationer. Denna procedur resulterar i utvinning (eller utarmning) av cytosola, kärnkraft, membran och cytoskelettproteiner och anrikningen av ECM-proteiner. Vi beskriver sedan hur man smälta ECM berikad proteinpreparat till peptider för efterföljande analys genom masspektrometri.
Under användning av procedurerna detaljerade och illustrerade här, har vi framgångsrikt berikas och kännetecknas av masspektrometri de extracellulära matriser från tio olika vävnader och tumörtyper: normal murin lunga 8, människa och mus kolon 8,9, human lever 9, humana kolorektala tumörer och härrör levermetastaser 9, melanom xenotransplantat 8, mammary tumörxenografter 10, murina pankreasöar och murina insulinom (Naba et al., opublicerade). Jämförelse av de olika matrisomes avslöjade vävnads- och tumörspecifika ECM signaturer som ytterligare skulle kunna användas som potentiella diagnostiska eller prognostiska biomarkörer.
Vi anser att detta förfarande kan tillämpas på andra prover med ingen eller relativt små modifieringar.
Modifieringar
Även om vi användes denna specifika procedur för att berika ECM från tio vävnader och tumörtyper 8 – 10, bör ändringar av protokollet anses i följande fall:
1) Detektion av ECM-proteiner i de mellanliggande fraktionerna.
Extracellulära matriser från olika vävnader eller tumörtyper kan skilja sig i deras extraherbarhet / olöslighet, som diskuterats ovan för fibronektin och lamininer. Till exempel, är det tänkt att ECM av fibrotiska vävnader eller ombyggnad vävnader omsätter mycket dynamiskt och därmed kan man observera en högre andel av ECM-proteiner i dessa vävnader att bli lättare kan extraheras 12. Beroende på den del där ECM-proteiner detekteras, föreslår vi att minska inkubationstiden för steg orsakar utvinning av ECM-proteiner eller utelämna det steget.
2) Detection av en betydande andel av intracellulära komponenter i ECM-anrikade pelleten. I vissa vävnader eller tumörtyper förhållande celler: ECM är särskilt höga (t.ex. lever, mjälte, icke-desmoplastic tumörer). I det fallet kan observeras en betydande förorening av ECM-anrikade fraktionen genom intracellulära proteiner (särskilt cytoskelettproteiner och / eller histoner). För att utarma intracellulära proteiner effektivt föreslår vi upprepade gånger inkubation i buffert M och / eller buffert CS (båda innehåller tvättmedel, detta utarmar vanligtvis rikliga intracellulära proteiner). Ett annat alternativ skulle vara att använda alternativa buffertar med högre koncentrationer tvättmedels, med förbehållet att detta kan leda till utarmning av relativt mer lösliga ECM-proteiner samt (se nästa stycke).
3) Alternativ till användning av ett kommersiellt kit.
Vi kunde inte, för farmaceutiska skäl, för att erhålla den exakta sammansättningen av buffertarna from leverantören av compartmental Protein Extraction kit. Men vi har i tabell 1 noter på grundval av vår egen erfarenhet av att använda hemmagjorda buffertar med definierade tvättmedel (NP-40, natriumdeoxikolat och SDS) koncentrationer att genomföra liknande extraktioner. En nyligen genomförd studie betonade också vikten av att pH-värdet i decellularisering buffertar för att behålla ECM-proteiner 13.
Begränsningar av tekniken
Den metod som presenteras här förlitar sig på det faktum att ECM-proteiner är i sig själva mer olösliga än de flesta intracellulära proteiner. Men beskrev decellularisering metoden här verkligen extraherar lösliga komponenter som finns inom ECM, såsom vissa tillväxtfaktorer eller ECM-ombyggnad enzymer. Även om ECM associerade proteiner tätt bundna till ECM-proteiner detekterades genom proteomik i prover framställda såsom beskrivits, kan denna metod vara alltför stränga för att profilera fullt sammansättningen av matrisome associeradeproteiner.
Betydelsen av tekniken med avseende på andra metoder
Fördelen med den metod som presenteras här jämfört med andra metoder är att den kan anpassas till arten av ECM av intresse: mellanliggande steg kan uteslutas eller upprepas för att förhindra förlust av ECM-proteiner eller öka förbrukningen av kontaminerande intracellulära proteiner respektive. Denna metod även använder endast minimala mängder av detergenter som sköljs av för att förhindra deras interferens med efterföljande peptidberedning och masspektrometri. Slutligen har den metod som beskrivs här för att smälta ECM rika proteinberedningar till peptider också fördelen av att inte kräva proteiner vara löslig och kan utföras på "råa" ECM-anrikade fraktioner.
Alternativa decellularisering metoder som utnyttjar kaotroper (såsom guanidinhydroklorid) att studera sammansättningen av ECM genom masspektrometri har been rapporterats i litteraturen (översikt i 14) och har använts i kombination med masspektrometri för att karakterisera ECM sammansättning brosk 15,16, hjärta 17, bröstkörtel 18 och vaskulära 19 och glomerulära 20 basalmembran.
Rekommendationer
Decellularisering metoder som använder trypsin att smälta ut celler bör inte användas om ECM anrikas för efterföljande proteomik analyser trypsinering kommer att resultera i partiell ECM nedbrytning och förlust av ECM-proteiner och peptider. Likaså om kollagenasspjälkning skulle användas för att underlätta avbrott vävnad, skulle det måste övervakas noga eftersom det orsakar ECM nedbrytning och förlust av ECM-proteiner och peptider.
I-lösning kontra in-gel matsmältningen? ECM-proteiner är tvärbundna och mycket olösliga och, även när återsuspenderades i 3x Laemmli-buffert (innehållande 6% SDS) och 100 mM DTT, separat poorly på SDS-geler. Således in-gel digestion är inte en föredragen metod.
Framtida tillämpningar
Det är värt att notera att även om de inte diskuteras här, sammansättningen av vart och ett av de mellanliggande fraktionerna som samlats in under decellulariseringen skulle också kunna analyseras med masspektrometri. Detta kan vara särskilt värdefullt när man studerar mycket små prover (dvs. mänskliga biopsier) eller när information önskas på andra cellulära fraktioner.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.
Section 1 | |||
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender |
Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145 |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en®ion=US |
Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/ |
Section 3 | |||
HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en®ion=US |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en®ion=US |
Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en®ion=US |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en®ion=US |
Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f |
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm |
Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/ |
Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en®ion=US |
Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade |
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 | http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383 |