स्टेटिक अंग संस्कृति का उपयोग कर तालु फ्यूजन का अध्ययन की विधि
Summary
तालू विकास के अध्ययन फांक तालु, एक जबरदस्त स्वास्थ्य बोझ लगाता है और विरूपण से स्थायी छोड़ सकते हैं कि एक जन्म दोष की घटनाओं से प्रेरित हैं। हम यहाँ तालु विकास और फ्यूजन में शामिल विभिन्न संकेत दे रास्ते अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि संस्कृति तालु समतल करने के लिए एक तकनीक का प्रदर्शन।
Abstract
फांक होंठ और तालू सभी जन्म दोष का सबसे आम के बीच में हैं। midline उपकला सीवन के लिए फार्म का पालन करता है कि उपकला के साथ कवर mesenchymal अलमारियों से माध्यमिक तालू रूपों (एमईएस)। सिद्धांतों एमईएस कोशिकाओं को एक दूसरे से जुड़ने तालू 1, जिससे mesenchymal संक्रमण (EMT), एपोप्टोसिस और पलायन करने के लिए एक उपकला का पालन करें कि सुझाव। एमईएस का पूरा विघटन mesenchymal कोशिकाओं के आसपास के साथ तालु संगम के अंतिम आवश्यक चरण है। हम तालू अंग संस्कृति के लिए एक विधि प्रदान करते हैं। इन विट्रो प्रोटोकॉल में विकसित संलयन के दौरान जैविक और आणविक प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है। इस तकनीक के अनुप्रयोगों बहिर्जात रासायनिक एजेंटों के लिए मूल्यांकन करने की प्रतिक्रियाएं, विनियामक और विकास कारकों और विशिष्ट प्रोटीन के प्रभाव सहित कई हैं। तालु अंग संस्कृति vivo अध्ययन में उपयोग संभव नहीं है कि विकास के विभिन्न चरणों में हेरफेर सहित लाभ के एक नंबर है।
Introduction
Orofacial clefts सबसे प्रमुख craniofacial जन्म दोष हैं। इसके अलावा, विचार में सभी संभव craniofacial दोष ले रही है, इन नवजात शिशुओं 2 में दूसरा सबसे आम जन्म विसंगति है। फांक palates के लगभग 1 संयुक्त राज्य अमेरिका (अमेरिका) में हर साल में हर 700 बच्चों के जन्म में कम पाए जाते हैं, तालु की घटनाओं फांक प्रति माह palates या 3 दिन प्रति clefts के साथ 15 बच्चों के साथ पैदा हुआ 475 बच्चों के बराबर है। बच्चों का लगभग 1% हर साल प्रदर्शनी में दुनिया भर के craniofacial dysmorphology के कुछ फार्म का जन्म।
तालू और होंठ के clefts इस विसंगति है, जो मरीजों के लिए आजीवन प्रभाव के साथ एक बहुत ही महंगे और जटिल प्रक्रिया की जरूरत है। मौखिक फांक साथ प्रत्येक रोगी के लिए अनुमानित लागत लगभग $ 100,000 4 है। फांक होंठ और तालू के साथ एक रोगी के उपचार, craniofacial सर्जन, Otolaryngologists, आनुवांशिकी, निश्चेतक सहित डॉक्टरों की एक टीम की आवश्यकताभाषण भाषा पैथोलॉजिस्ट, पोषण विशेषज्ञ, Orthodontists, Prosthodontists, मनोवैज्ञानिक, न्यूरो सर्जन, और नेत्र रोग विज्ञानियों।
Palatogenesis में, माध्यमिक तालू शुरू में खड़ी बढ़ने और जीभ की पीठ के ऊपर तालु शेल्फ ऊंचाई से गुजरना जो बनती outgrowths, के रूप में उठता है। पदोन्नति के बाद बनती तालु समतल (मानव में चूहों में E14.5 -E15 पर और सप्ताह 9) midline की ओर बढ़ता है। शेल्फ टिप को शामिल किया गया है कि औसत दर्जे बढ़त उपकला (इ) midline उपकला सीवन के गठन का पालन करता है।
इस mesenchymal संगम अनुमति देने के लिए mesenchymal संक्रमण और / या apoptosis को उपकला द्वारा पीछा किया जाता है। विरोध करने इ के आसंजन जिसका परिवर्तन तालु का कारण बनता है एक अनिवार्य घटना है। हालांकि, केवल कुछ अध्ययनों तालु अलमारियों 5 की प्रारंभिक आसंजन की जांच की। अस्थिकोरक में mesenchymal कोशिकाओं के भेदभाव से कठिन तालू रूपों। कुंजी उत्पादन कर सकते हैं तालू की असामान्य विकासटी के साथ या होंठ की भागीदारी के बिना palates।
तालु अंग संस्कृति तकनीक पिछले 30 साल से 6.7 पर कई प्रयोगशालाओं के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया था।
इस प्रोटोकॉल में हम विवरण में तालु विच्छेदन और स्थिर अंग संस्कृति की एक विधि का वर्णन है। एक स्तब्ध अंग संस्कृति का लाभ यह है तालु अलमारियों फ्यूज करने के लिए अनुमति देता है। इस तकनीक में कई विलय और संकेतन प्रयोगों 8,9 के लिए हमारी प्रयोगशाला में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया था। तकनीक के दायरे विशाल है और स्थिर अंग संस्कृति प्रणाली बहिर्जात रासायनिक एजेंटों के लिए प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन सहित आवश्यक है, जब भी इस्तेमाल किया जा सकता हालांकि, अलग अलग रास्ते और विशिष्ट प्रोटीन में नियामक विकास कारकों का प्रभाव।
चित्रा 1. माउस Palatogenesis। चूहों तालू के विकास के चरणों। (बीएफ) स्कैनिंग हाथीप्रतिनिधि विकासात्मक समय पर माध्यमिक तालू के ctron micrographs (SEM)। लाल तीर: तालु आसंजन और फ्यूजन की प्रारंभिक हिस्सा दिखा। पीले तीर: संलयन के बाद गायब हो जाएगा कि प्राथमिक और माध्यमिक palates के बीच अंतरिक्ष के लिए बिंदु (PLoS एक से अनुमति के साथ कॉफ़मैन 11 से reprinted)।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में प्रोटोकॉल भ्रूण दिन 13.5 पर भ्रूण से तालु अलमारियों विदारक का एक तरीका प्रदान करता है। माउस भ्रूण से तालु अलमारियों 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% ओ 2 से 5% सीओ 2 के माहौल में एक सीरम मुक्त संस्कृत?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have any acknowledgements.
Materials
| BGJb | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | 100x15mm |
| Center-well organ culture dish | Falcon | #353037 | 60×15 mm |
| Wire triangular grid | Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well. | ||
| Polycarbonate filter | GE& Water and Process Technologies | K04BP04700 | Black 0.4 micron, 47 mm |
| Stereo microscope | ZEISS Stemi SR | ||
| Culture hood | NUAIRE Laminar Flow | ||
| Microdissecting forceps | Dumont Medical | #5 | |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | Vannas Scissors, straight, 8cm long, 0.1mm tips, 5mm blades, German made |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas Scissors, straight, 8.5cm long, 0.025mm x 0.015mm tips, 7mm blades |
| Microdissecting scissors | Kent Scientific Corporation | INS14127-G | Spring scissors curved curved, 10.5cm long, 8mm blades, German made |
| Surgical currete (spoon spatula) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| Protector laboratory hood | Labconco | ||
| Incubator | Thermo Scientific | Farma | |
| Series11 water Jacket | |||
| Co2 incubator | |||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | 1X |
| Fiber optic Light source | Fiber-light Dolan-Jenner | PL-750 | |
| Embedding cassette | Statlab | EC301 | |
| Kim Wipes | VWR | 470173-504 | |
Referências
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